Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

РОЛЬ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ

Щеголев А.И. 1, 2 Мишнёв О.Д. 2
1 ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
2 ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России
Проведен анализ возможностей применения иммуногистохимических маркеров для диагностики и дифференциальной диагностики гепатоцеллюлярной карциномы. Наиболее существенную помощь для подтверждения печеночно-клеточной природы новообразования оказывает иммуногистохимическое выявление альфа-фетопротеина, глипикана-3, глутаминсинтетазы и аргиназы. Указаны особенности иммуногистохимической экспрессии раково-эмбрионального антигена, цитокератинов, белка теплового шока 70 при карциноме печени. Подчеркнута особая роль маркеров кровеносных сосудов, отражающих процессы опухолевого неоангиогенеза и коррелирующих с лучевыми характеристиками опухолей печени. Отмечена роль PCNA и Ki-67 для оценки уровня пролиферации опухолевых клеток. Сделан вывод, что иммуногистохимическое исследование закономерно считается эффективным методом патогистологического исследования, позволяющим проводить объективную диагностику гепатоцеллюлярной карциномы, дифференциальную ее диагностику с опухолеподобными изменениями и метастазами других новообразований, а также определять прогноз заболевания.
печень
гепатоцеллюлярная карцинома
диспластический узелок
иммуногистохимия
1. Состояние онкологической помощи населению России в 2015 году / Под ред. А.Д. Ка-прина, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2016.
2. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2012.
3. Туманова У.Н., Кармазановский Г.Г., Дубова Е.А., Щеголев А.И. Сравнительный анализ степени васкуляризации гепатоцеллюлярного рака и очаговой узловой гиперплазии печени по данным компьютерно-томографического и морфологического исследований // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2013. – № 12. – С. 9–15.
4. Туманова У.Н., Кармазановский Г.Г., Щеголев А.И. Денситометрические характеристики гепатоцеллюлярного рака при спиральной компьютерной томографии // Медицинская визуализация. – 2012. – № 6. – С. 42–49.
5. Туманова У.Н., Кармазановский Г.Г., Яшина Н.И., Щеголев А.И. Диагностическая значимость компьютерно-томографических характеристик узлов гепатоцеллюлярного рака в зависимости от размера // REJR. – 2016. – Т. 6. № 4. – С. 44–55.
6. Туманова У.Н., Щеголев А.И. Ангиогенез при гепатоцеллюлярном раке // Успехи современной биологии. – 2015. – Т. 135. № 2. – С. 164–176.
7. Туманова У.Н., Щеголев А.И. Васкуляризация гепатоцеллюлярного рака // Архив патологии. – 2015. – № 2. – С. 50–55.
8. Щеголев А.И., Дубова Е.А., Туманова У.Н. Васкуляризация ткани гепатоцеллюлярного рака зависит от степени его дифференцировки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – № 4. – С. 480–484.
9. Щеголев А.И., Мишнев О.Д. Онкоморфология печени. – М.: Издательство РГМУ, 2006.
10. Щеголев А.И., Туманова У.Н., Мишнев О.Д. Классификация и морфологическая характеристика гепатоцеллюлярных узелковых поражений печени // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 1–1. – С. 71–75.
11. Baumhoer D., Tornillo L., Stadlmann S. et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples // Am. J. Clin. Pathol. – 2008. – V. 129. – P. 899–906.
12. Bioulac-Sage P., Balabaud C., Zucman-Rossi J. Subtype classification of hepatocellular adenoma // Dig. Surg. – 2010. – V. 27. – P. 39–45.
13. Di Tommaso L., Franchi G., Park Y.N. et al. Diagnostic value of HSP70, glypican 3, and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis // Hepatology. – 2007. – V. 45. – P. 725–734.
14. Hytiroglou P., Park Y.N., Krinsky G., Theise N.D. Hepatic precancerous lesions and small hepatocellular carcinoma // Gastroenterol. Clin. North. Am. – 2007. – V. 36. – P. 867–887.
15. Jolly C., Morimoto R.I. Role of the heat shock response and molecular chaperones in oncogenesis and cell death // J. Natl. Cancer Inst. – 2000. – V. 92. – P. 1564–1572.
16. Kakar S., Gown A.M., Goodman Z.D. et al. Best practices in diagnostic immunohistochemistry: hepatocellular carcinoma versus metastatic neoplasms // Arch. Pathol. Lab. Med. – 2007. – V. 131. – P. 1648–1654.
17. Krishna M. Diagnosis of metastatic neoplasms: an immunohistochemical approach // Arch. Pathol. Lab. Med. – 2010. – V. 134. – P. 207–215.
18. Luo Y., Ren F., Liu Y. et al. Clinicopathological and prognostic significance of high Ki-67 labeling index in hepatocellular carcinoma patients: a meta-analysis // Int. J. Clin. Exp. Med. – 2015. V. 8. – P. 10235–10247.
19. Maeda T., Kajiyama K., Adachi E. The expression of cytokeratins 7, 19, and 20 in primary and metastatic carcinomas of the liver // Mod. Pathol. – 1996. – V. 9. – P. 901–909.
20. Mohamed W.S., Omar M.M., Khayri T.M., Fakhr I.M. Assessment of the pro¬liferative marker Ki-67 and p53 protein expression in HBV- and HCV-related hepatocellular carcinoma cases in Egypt // Int. J. Health Sci. (Qassim). – 2008. – V. 2. – P. 27–34.
21. Morrison C., Marsh W.Jr., Frankel W.L. A comparison of CD10 to pCEA, MOC-31, and hepatocyte for the distinction of malignant tumors in the liver // Mod. Pathol. – 2002. – V. 15. – P. 1279–1287.
22. Park Y.N., Chae K.J., Kim Y.B. et al. Apoptosis and proliferation in hepatocarcinogenesis related to cirrhosis // Cancer. 2001. – V. 92. – P. 2733–2738.
23. Shin E., Ryu H.S., Kim S.H. et al. The clinicopathological significance of heat shock protein 70 and glutamine synthetase expression in hepatocellular carcinoma // J. Hepatobiliary. Pancreat. Sci. – 2011. – V. 18. – P. 544–550.
24. Yan B.C., Gong C., Song J. et al. Arginase-1: a new immunohistochemical marker of hepatocytes and hepatocellular neoplasms // Am. J. Surg. Pathol. – 2010. – V. 34. – P. 1147–1154.

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) входит в группу наиболее распространенных злокачественных опухолей с высокими показателями летальности. Самые высокие показатели заболеваемости отмечаются в странах Азии и Африки. В России на конец 2015 года на учете находилось 7360 пациентов, страдающих ГЦК, при этом летальность составила 43,6 % [1]. Единственным методом, позволяющим сделать объективное заключение, определяющее тактику лечения и прогноз заболевания, является гистологическое изучение биопсийного или операционного материала. Существенную, а в ряде случаев и ведущую, роль в диагностике и дифференциальной диагностике играют иммуногистохимические методы исследования [2].

Цель работы: анализ возможностей применения иммуногистохимических маркеров для диагностики и дифференциальной диагностики гепатоцеллюлярной карциномы.

Одним из первых маркеров, внедренных в практику иммуногистохимического ис-следования препаратов ткани печени, был альфа-фетопротеин. Последний представляет собой гликопротеин, который образуется в тканях (преимущественно в печени, кишечнике и желточном мешке) при развитии эмбриона и плода. В этой связи в нормальной ткани печени взрослого человека альфа-фетопротеин не определяется. Наряду с этим альфа-фетопротеин является достаточно специфичным маркером гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). По данным литературы [16], положительная цитоплазматическая иммуногистохимическая реакция с альфа-фетопротеином отмечается в 25–40 % наблюдений ГЦК, имея нередко при этом очаговый характер. То есть данный иммуногистохимический маркер характеризуется относительно низкой чувствительностью, особенно при низкодифференцированных формах ГЦР. Вместе с тем, определение уровня альфа-фетопротеина в сыворотке крови считается эффективным методом для диагностики и контроля эффективности лечения ГЦК.

Большинство опухолевых клеток, представляющих аденокарциномы, характеризуются диффузной цитоплазматической реакцией с поликлональным раково-эмбриональным антигеном (пРЭА). Поскольку в состав пРЭА наряду с белками входит и билиарный гликопротеин, то иммуногистохимическая картина пРЭА в ткани ГЦК носит специфический характер в виде так называемой мелкой проволочной сетки курятника («chicken-wire fence»). Такая типичная картина канальцев отмечается в 60–90 % наблюдений высоко- и умереннодифференцированных ГЦК и в 25–50 % – низкодифференцированных форм [16, 21]. К сожалению, примерно в половине анализируемых препаратов наблюдается и цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток, что затрудняет проведение дифференциальной диагностики с метастатическими аденокарциномами. При этом моноклональный РЭА в ткани ГЦК не выявляется.

Для подтверждения эпителиальной природы новообразования используются различные цитокератины (ЦК). При этом нормальные и опухолевые гепатоциты характеризуются положительной реакцией на ЦK 8 и 18, в то время как реакция на ЦК 7, 19 и 20 – отрицательная [16, 19]. В этой связи реакция на цитокератины используется для дифференциальной диагностики ГЦГ как от метастазов, так и предопухолевых гепатоцеллюлярных поражений [9]. Действительно, в качестве дифференциально-диагностического признака диспластических узелков высокой степени и ранней ГЦК на фоне цирроза печени используется оценка стромальной инвазии, характерная для ГЦК. В качестве уточняющего метода рекомендуется иммуногистохимическое выявление ЦК 7 и 19: наличие положительной реакции в протоках свидетельствует о псевдоинвазии и не требует верификации ГЦК [10].

Высокочувствительным и высокоспецифичным маркером печеночно-клеточной дифференцировки является антитело HepPar-1, реагирующее с ферментом цикла мочевины карбамил фосфат-синтазой митохондрий печени. В этой связи на иммуногистохимических препаратах положительная реакция проявляется в виде зерен в цитоплазме нормальных и опухолевых гепатоцитов. К сожалению, HepPar-1 не является патогномоничным показателем гепатоцитов, поскольку он также реагирует с митохондриями эпителия канальцев почек и кишечного эпителия. Тем не менее, HepPar-1 признан наиболее адекватным маркером ГЦК печени, так как его экспрессия определяется у 80–90 % больных. При этом интенсивность окрашивания ослабевает по мере снижения степени дифференцировки карциномы, а в ткани низкодифференцированной и скиррозной ГЦК может даже не определяться [16]. Кроме того, положительная очаговая реакция HepPar-1 может наблюдаться при карциноме легкого, пищевода, желудка, толстой кишки, желчного пузыря, шейки матки, надпочечника, а также в ткани меланомы и параганглиомы [17],

Другим маркером печеночно-клеточной дифференцировки является аргиназа (ARG1), катализирующая расщепление аргинина на орнитин и мочевину. Иммуногистохимическими методами определяется в ядре и цитоплазме клеток. По мнению B.C. Yan с соавт. [24], ARG1 обладает большей чувствительностью и специфичностью по сравнению с HepPar-1, особенно при анализе низкодифференцированной ГЦК. Однако имеются указания, что ARG1 может также выявляться в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.

В последнее время для дифференциальной диагностики ГЦК все чаще стали использовать глипикан-3 (GPC3), представителя семейства гепаран-сульфат протеогликанов, сцепленных с клеточной поверхностью при помощи фосфатидилинозитолового якоря. Глипикан-3 определяется в плаценте и печени плода, участвуя в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. В нормальных гепатоцитах печени взрослого человека не определяется. В то же время в ткани ГЦК глипикан-3 выявляется преимущественно в виде цитоплазматического и иногда мембранного или канальцевого окрашивания: в 69 % наблюдений высоко дифференцированных и в 81 % – умеренно дифференцированных форм [13]. Важным моментом является то, что глипикан-3 характеризуется большей чувствительностью по сравнению с HepPar-1 в ткани низкодифференцированной ГЦК [16]. По данным D. Baumhoer с соавт. [11], положительная экспрессия глипикана-3 наблюдается и в отдельных диспластических узелках высокой степени, что свидетельствует об их предопухолевой природе. Наряду с этим, реакция на глипикан-3 отсутствует в ткани гепатоцеллюлярной аденомы, очаговой узловой гиперплазии и при циррозе печени. К отрицательным моментам следует отнести отдельные случаи отрицательной реакции в наблюдениях высоко дифференцированной ГЦК и, наоборот, положительной реакции в ткани меланомы, карциномы желудка, плоскоклеточной карциномы легкого и герминогенных опухолей (хориокарциномы и опухолей желточного мешка) [16].

Еще одним маркером ГЦК является так называемый белок теплового шока 70 (HSP70), входящий в семейство белков теплового шока и имеющий молекулярную массу 70 кДа. Данные белки действуют как внутриклеточные шапероны, а также обладают выраженным антиапоптотическим эффектом [15]. При иммуногистохимическом исследовании HSP70 характеризуется ядерной и цитоплазматической реакцией и отмечается в 78 % наблюдений высоко дифференцированной и в 67 % – умеренно и низкодифференцированной ГЦК. Кроме того, он обнаруживался в 5 % диспластических узелков высокой степени и отсутствовал в диспластических узелках низкой степени [13]. E. Shin с соавт. [23] показали высокую корреляцию выраженной экспрессией HSP70 с размерами ГЦК, степенью гистологической дифференцировки и наличием сосудистой инвазии. Примечательно, что положительная реакция с HSP70 наблюдается и в эпителии желчных протоков, что рекомендуется использовать в качестве внутреннего контроля постановки реакций [13].

Основной функцией глутаминсинтетазы считается участие в детоксикации аммиака. В то же время ген глутаминсинтетазы активируется в результате ядерной транслокации бета-катенина. Видимо, именно поэтому в клетках бета-катенин-активированной гепатоцеллюлярной аденомы отмечается диффузная реакция глутаминсинтетазы. И это, видимо, также является основным фактором повышенного риска злокачественной трансформации данного типа гепатоцеллюлярных аденом. В нормальной же ткани печени положительная реакция глутаминсинтетазы наблюдается лишь в первом и втором слое гепатоцитов, окружающих терминальную печеночную венулу [12]. Развитие и прогрессирование ГЦК сопровождается увеличением частоты иммуногистохимического выявления глутаминсинтетазы в виде диффузной цитоплазматической окраски. Так, глутаминсинтетаза определяется в 14 % диспластических узелков высокой степени, в 59 % наблюдений высоко дифференцированной и в 86 % умеренно дифференцированной ГЦК [13].

Особую роль среди иммуногистохимических показателей ГЦК занимают маркеры кровеносных сосудов, поскольку наряду с диагностическими возможностями они могут использоваться и в качестве факторов прогноза. Действительно, многошаговый гепатоканцерогенез от предракового поражения до инвазивной формы опухоли сопровождается изменениями, как в структуре сосудов, так и ее кровоснабжении [6]. Так, по данным иммуногистохимического исследования эндотелиоциты нормальных синусоидов и при циррозе печени характеризуются отрицательной реакцией с антителами CD31 и CD34, в то время как эндотелиальные клетки сосудов в ткани диспластических узелков и ГЦК имеют положительную экспрессию данных маркеров. То есть реакцию с CD34 не рекомендуется использовать для дифференциальной диагностики диспластических узелков и ранней ГЦК.

Прогрессирующие процессы капилляризации синусоидов взаимосвязаны и со степенью злокачественности новообразования. В участках высокодифференцированной ГЦК встречаются как обычные синусоиды, так и микрососуды капиллярного типа, а при низкодифференцированной форме – только капилляры [7]. При этом синусоиды в высокодифференцированной ГЦК характеризуются неполной капилляризацией: положительные реакции на CD34 и ламинин являются слабыми и только местами. В процессе дедифференцировки отмечается увеличение площади участков с CD34-положительной реакцией и развитие признаков полной капилляризации, как это отмечается в умеренно-дифференцированном ГЦК. Согласно проведенным нами исследованиям [8], морфологические показатели васкуляризации ткани ГЦК зависят от размера узлов и степени гистологической дифференцировки. Максимальные значения количества и суммарной площади сечения CD34 положительных сосудов установлены в новообразованиях диаметром не более 5 см, а наименьшие – в опухолях размером более 10 см. Наибольшие значения показателя васкуляризации выявлены в ткани высоко дифференцированной ГЦК, а наименьшие – в наблюдениях низкодифференцированных карцином.

Следует также добавить, что изменения неоангиогенеза отражаются и на лучевых характеристиках образований: диспластические узелки обычно выглядят как изо- или гиповаскулярные участки, ГЦК же имеет характеристики гиперваскулярности в артериальную фазу исследования [14]. При этом лучевые характеристики выраженной ГЦК зависят также от размеров опухолевого узла [5] и степени гистологической дифференцировки [3, 4].

Важным моментом морфологического изучения ткани опухоли является оценка степени пролиферации ее клеток. К основным иммуногистохимическим маркерам, используемым для определения индексов пролиферации, относятся PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) и Ki-67, которые определяются в ядрах пролиферирующих клеток. При этом Ki-67 не экспрессируется в фазу G0. При иммуногистохимическом анализе PCNA положительных клеток было показано прогрессирующее увеличение их количества в ряду, отражающим этапы гепатоканцерогенеза: регенеративные узелки (2,6 ± 1,35), диспластические узелки низкой степени (15,3 ± 10,5), диспластические узелки высокой степени (25,4 ± 5,25), маленькая ГЦК (34,9 ± 15,7) [22]. Дальнейшее прогрессирование ГЦК (стадия I – IV) тоже сопровождается с увеличением количества Ki-67 положительных клеток [20]. При этом на основании проведенного мета-анализа Y. Luo с соавт. [18] установили, что более высокие значения индекса пролиферации клеток (по Ki-67) сочетаются не только с более высокой степенью злокачественности, но и с бoльшими размерами и количеством узлов, наличием сосудистой инвазии и метастазов.

Характеризуя иммуногистохимические маркеры, применяемые для верификации ГЦК, необходимо добавить, что эффективность такой диагностики повышается при использовании несколько антител. Как мы уже указывали, чувствительность и специфичность глутаминсинтетазы при диагностике высоко дифференцированной ГЦК составляет 59 % и 86 % соответственно, глипикана-3 – 69 % и 91 %, белка теплового шока 70–78 % и 95 % соответственно. Использование же двух из трех этих антител повышало чувствительность до 72 % и специфичность до 100 %. Наиболее эффективным, по мнению [13], является применение белка теплового шока 70 и глипикана-3.

Таким образом, иммуногистохимическое исследование закономерно считается эффективным методом патогистологического исследования, позволяющим проводить объективную диагностику гепатоцеллюлярной карциномы, дифференциальную ее диагностику с опухолеподобными изменениями и метастазами других новообразований, а также определять прогноз заболевания.


Библиографическая ссылка

Щеголев А.И., Мишнёв О.Д. РОЛЬ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 2-1. – С. 37-41;
URL: http://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=11213 (дата обращения: 28.02.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074