Молочные продукты являются одними из важных составляющих сбалансированного питания человека, источником незаменимых для организма веществ в наиболее эффективно усвояемой форме. В результате интенсивного экономического развития, сопровождаемого ростом населения и улучшением его благосостояния, а также изменениями в диетологии, происходит активный рост потребления молочной продукции. Производство молока, его стоимость и импорт постоянно растут в последние годы, особенно в Азии, Африке и Латинской Америке. По прогнозам экспертов (International Farm Comparison Network – IFCN), к 2030 г. спрос на молоко и молочную продукцию в мире вырастет на 35 %, или на 304 млн т. Прогнозируемый IFCN рост может быть обеспечен в том числе за счет России, уровень потребления молочной продукции в которой сейчас находится на достаточно низком уровне. В связи с этим очевидна важность развития молочного скотоводства как одной из приоритетных и перспективнейших отраслей экономики страны. Биологические ограничения в настоящее время пока еще не стали лимитирующими факторами ее развития, и потенциал для увеличения удоев все еще остается существенным [1]. Тем не менее быстрые и рассчитанные на перспективу результаты в развитии отечественного агропромышленного комплекса могут быть достигнуты с помощью невозможных ранее вмешательств на генетическом уровне. Генетические улучшения включают изменения кодирующего генома крупного рогатого скота (КРС), а также микробиома, управление которыми, как ожидается, станет частью рутинного управления стадом [1].
Значительный вклад в улучшение генома КРС и в конечном итоге в управление процессом генетического совершенствования популяции (его продуктивности, здоровья, повышения фертильности, обеспечения продуктивного долголетия, сокращения расходов за счет уменьшения заболеваемости и снижения вероятности врожденных дефектов и других параметров), вносят развиваемые в настоящее время ускоренными темпами геномные и генно-инженерные технологии. Для достижения генетического улучшения популяции КРС необходима надежная оценка племенных и продуктивных качеств быков-производителей и маточного поголовья, высокая степень наследования изменяемого признака и сокращение генерационного интервала, чему может способствовать использование технологий модификации генома и ускоренного воспроизводства КРС. Генно-инженерные и геномные технологии, направленные помимо повышения продуктивности молочного скота на улучшение его репродуктивной эффективности, остаются наряду с технологией трансплантации эмбрионов наиболее перспективными подходами, способными сыграть важнейшую роль в решении проблемы продовольственного снабжения населения [2, 3].
Примерами новых возможностей этих технологий могут служить уже имеющиеся результаты получения трансгенных животных, устойчивых к серьезным инфекционным заболеваниям за счет интегрирования в геном генных конструкций, связанных с усилением иммунитета, с улучшенными важнейшими хозяйственно ценными признаками, а также продуцентов биологически активных веществ [4–6]. Следует особо отметить, что практика применения геномных технологий найдет свое положительное отражение в процессе формирования высокопродуктивного поголовья КРС отечественной селекции.
Современные технологии и инструменты модификации генов и редактирования генома КРС имеют огромный экономический потенциал [7–9]. Однако крупномасштабные программы по разведению КРС достаточно сложны, поскольку для них требуется непрерывный отбор. Поэтому, насколько это известно, пока не появилось долгосрочных программ разведения генетически модифицированных животных для производства продуктов питания [10]. Такие программы представляют интерес, даже если модифицирование генов или редактирование генома может улучшить один или несколько хозяйственно ценных признаков. Учитывая высокую эффективность и низкую себестоимость инструментов редактирования генома, в частности CRISPR/Cas9 [11], можно предполагать получение в ближайшем будущем популяций элитных молочных коров c измененными характеристиками.
В данном обзоре основное внимание сфокусировано на актуальных направлениях геномных и генно-инженерных технологий в молочном скотоводстве, направленных на улучшение на долгосрочной основе широкого спектра характеристик, для получения элитных животных с улучшенными генетическими свойствами [12–14].
Цель исследования: обзор перспективных направлений геномных и генно-инженерных технологий, которые могут быть востребованы в молочном скотоводстве в относительно краткосрочной перспективе.
Генетические модификации
Возможно выделить три уровня генетических изменений: (1) редактирование генома путем замены нескольких нуклеотидов на варианты, уже известные для данного вида; (2) использование векторов для передачи генетического материала для создания более обширных изменений внутри вида; (3) введение генетического материала другого вида.
Европейским органом по безопасности пищевых продуктов генетические модификации определяются как «генетические изменения животного, связанные с изменением его генетического материала путем добавления, изменения или удаления определенной последовательности ДНК, не встречающимся в природе способом. Оно имеет целью изменение конкретных характеристик животного или введение новой характеристики, такой как устойчивость к болезням или усиление роста» [15]. Получение трансгенного животного подразумевает введение последовательностей ДНК из другого организма с использованием генной инженерии, что ранее было невозможно осуществить методами традиционной селекции. Для генетической модификации, чтобы быть унаследованной, она должна присутствовать в гаметах и быть интегрированной в хромосому.
В случае геномного редактирования, никакая чужая ДНК не включается в геном, однако отсутствует консенсус относительно признания «генетически модифицированными» организмов с отредактированным геном [16, 17]. Подобные генетические изменения могут как иметь место, так и не случиться в естественных условиях у того же вида или породы.
Генная инженерия
Генная инженерия является инструментом для получения генетически модифицированных организмов с желательными признаками с использованием рекомбинантной ДНК [18]. Инструментами генной инженерии в животноводстве являются: пронуклеарная микроинъекция, характеризующаяся низкой эффективностью и случайной интеграцией ДНК в целевой геном [19], использование вирусных векторов [20] и пересадка ядер соматических клеток (SCNT) [21]. Несмотря на недостатки SCNT (проблема вынашивания, аномалии и низкое количество жизнеспособных потомков [22] и отсутствие истинных плюрипотентных клеток крупных домашних животных [23], использование SCNT и микроинъекции рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы эмбрионов остаются основными методами создания генетически модифицированного скота [8].
Применение генной инженерии в молочном скотоводстве концентрируется в первую очередь вокруг изменения свойств молока с использованием известных генов для улучшения его состава и обеспечения здоровья вымени лактирующих коров, а также их устойчивости к заболеваниям, что благоприятно отражается в целом на жизнеспособности популяции [24].
Работа с КРС имеет дополнительные трудности из-за низкой эффективности воспроизводства и длительного периода беременности. Тем не менее, благодаря методам генной инженерии, уже были получены трансгенные линии КРС, экспрессирующие в молоке рекомбинантный человеческий лактоферрин [25]. Получены генетически модифицированные животные с измененным белковым составом молока, а именно с увеличенным содержанием бета- и альфа-казеинов [26]; с экспрессией лизоцима человека [27], со сниженным количеством бета-лактоглобулина [28]; с устойчивостью к маститу, вызываемому Staphylococcus aureus, за счет введения гена лизостафина (антибактериальной глицилглицин эндопептидазы) [24]. При этом генетическую модификацию животных с целью их использования в качестве биореакторов для производства фармакологических препаратов осуществляют чаще, нежели для получения продуктов питания. Описание других успехов, достигнутых с использованием технологий генной инженерии КРС, можно найти в ряде обзоров [7, 29]. Использование генной инженерии в молочной промышленности может привести ко многим улучшениям, ранее невозможным при традиционных методах селекции.
Улучшение здоровья, устойчивость к инфекционным заболеваниям и увеличение продуктивности КРС, ограничение использования антибиотиков и уменьшение воздействия животноводства на окружающую среду являются одними из важнейших целей и перспектив использования генно-инженерных технологий в молочном скотоводстве [7].
Существующий в ряде стран запрет на использование генетически модифицированных животных и произведенных ими продуктов в связи с их воздействием на окружающую среду, проблема безопасности пищевых продуктов, неизвестность последствий предполагаемых изменений генома, этическими проблемами и общей готовностью общества остаются до сегодняшнего дня серьезными препятствиями, ограничивающими применение этой технологии в животноводстве.
Редактирование генома
Технология геномного редактирования представляет собой изменение генома организмов посредством адресного манипулирования нуклеотидными последовательностями генов для достижения целенаправленной модификации эндогенных генов или интеграции экзогенных генов, приводя к изменению их функционального статуса. Новая технология редактирования генома позволяет не только редактировать или «исправлять» нежелательные мутации, но также создавать новые аллельные варианты в геноме [30]. Она позволяет генерировать практически все типы мутаций, в результате которых животные могут получить новые характеристики, отсутствующие в естественных популяциях, а также значительно улучшить имеющиеся. Геномное редактирование отличается от генной инженерии тем, что не связано с использованием рекомбинантной ДНК и способствует использованию новым способом существующих вариаций внутри вида. Существующие параллели между традиционными методами отбора и геномным редактированием выражаются в увеличении частоты благоприятных аллелей у видов. Преимущества редактирования генов при этом проявляются в способности быстро и без ошибок передавать соответствующие аллельные варианты генов, не полагаясь на случайную передачу благоприятных комбинаций аллелей.
Включение, удаление или перемещение фрагментов ДНК в геноме организма происходит с использованием специфически спроектированных, высокоэффективных эндонуклеаз, или «молекулярных ножниц». В настоящее время инструменты для редактирования генома включают ZFN (zinc finger nuclease – цинк-пальцевые нуклеазы), TALEN (Transcription activator-like effector nucleases – эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции) и CRISPR/Cas9 (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats – сгруппированные короткие промежуточные палиндромные повторы, разделенные промежутками и ассоциированные с нуклеазой Cas9) [31–33], которые успешно применяются для изменения геномов растений и животных. TALE – это белки протеобактерии рода Xanthomonas используемые для подавления транскрипционной активности в клетках растений-хозяев, состоящий из множества ДНК-связывающих компонентов, способных к взаимодействию лишь с одним основанием ДНК в соотношении 1:1. Это свойство было использовано для создания комплексов, способных связывать практически любую последовательность в геноме. Аналогично ZFN, комплекс TALE сливается с нуклеазой FokI для получения TALEN, тем самым обеспечивая димеризацию FokI для целенаправленного разрезания ДНК. TALEN более широко используются в исследованиях в животноводстве, чем ZFN, в основном из-за их относительной простоты проектирования и синтеза [34, 35]. Cas9 позволяет расщеплять практически любую нуклеотидную последовательность, комплементарную направляющей РНК, но в отличие от TALEN и ZFN, ее избирательность является следствием комплементарности направляющей РНК и ДНК, а не модификации самого белка. Поэтому для новых ДНК-мишеней возможна выработка специфических Cas9 [36].
Все эти современные инструменты редактирования геномов позволяют осуществлять сайт-специфичные разрывы двухцепочечной ДНК генома в нужном месте, после чего система репарации ДНК восстанавливает эти двухцепочечные разрывы путем негомологичного соединения концов (NHEJ – Non-homologous end joining) или гомологичной рекомбинации (HDR – homology directed repair), что позволяет получать направленные мутации [37]. NHEJ – это путь восстановления ДНК в клетках, который соединяет разорванные концы непосредственно без участия гомологичной матрицы. Во время процесса восстановления путем NHEJ происходит удаление или вставка нуклеотидов, что приводит вследствие этого к ошибкам, связанным со сдвигом рамки считывания. Таким образом, с помощью NHEJ с вовлечением нуклеазы может быть получен нокаут целевого гена [38]. В противоположность NHEJ, HDR происходит в клетках с более низкой частотой, но восстановление осуществляется через гомологичную рекомбинацию между донорской матрицей ДНК и целевым геномным локусом, в результате чего происходит вставка донорской ДНК. Следовательно, HDR с использованием нуклеазы применяется для получения направленного нокаута или замены аллеля [39].
На сегодняшний день почти любая лаборатория может проводить эксперименты по редактированию генома, охватывая любые виды, представляющие интерес. Для улучшения хозяйственно ценных признаков сельскохозяйственных животных с помощью генетических манипуляций необходимо точное редактирование генома в нескольких локусах, поскольку важные в производственном отношении свойства часто контролируются несколькими генами [37]. Различные сайты мутаций или типы мутаций в одном и том же гене могут также сильно влиять на важные признаки, имеющие значение, например, для воспроизводства [37]. Следовательно, значительное улучшение продуктивных признаков скота требует точного редактирования во множестве мест генома. Разработка жизнеспособной линии скота на основе множественных изменений генома не является тривиальной задачей, поскольку необходимо производить множество редактирований для сохранения генетических вариаций и избегать чрезмерного уровня инбридинга [30]. Способность осуществлять несколько изменений генома одновременно сделает технику более полезной для улучшения количественных признаков и ожидается, что это станет реальностью в короткой перспективе [30]. Достижения в понимании влияния различных генов и геномных вариантов на фенотипы и повышение эффективности мультиплексного редактирования генома будет способствовать открытию новых возможностей для улучшения количественных характеристик в молочном животноводстве, а также повышению эффективности разведения животных и выведению животноводства на новый уровень.
Примерами могут служить успешное получение нокаута гена b-лактоглобулина у КРС – основного белка и одного из важнейших аллергенов в сыворотке коровьего молока – с использованием технологии ZFN [40]; введение гена лизоцима человека (Hlyz) в локус генома КРС, кодирующего b-казеин с применением ZFNs, в результате чего молочная железа трансгенного животного может секретировать лизоцим человека, убивающий в молоке S. aureus, тем самым защищая его от самого распространенного заболевания молочного скота – мастита [41]; получение трансгенных животных, менее восприимчивых к туберкулезу с помощью технологии TALEN путем введения гена SP110 в геном КРС [42]; совместная ZFN и TALEN модификация эмбрионов КРС, приводящая к введению мутаций, приводящих к разрушению локуса b-лактоглобулина у видов домашнего скота [43]; получение КРС с успешным нокаутом гена миостатина MSTN, сдерживающего рост мышц для предотвращения их дистрофии, с использованием TALEN [34]; применение метода редактирования генома TALEN для введения аллеля POLLED, связанного с отсутствием рогов у молочного голштинского КРС, что привело к получению комолых животных [44].
Технология редактирования генома позволяет быстро изменять ключевые гены, влияющие на целевые признаки, и получать требуемые генотипы через одно поколение, тем самым значительно ускоряя селекционный процесс [7].
С продолжающимся снижением стоимости секвенирования генома [45], возможно ожидать получения новой информации о генетических вариациях, влияющих на производственно-важные признаки КРС. Например, потенциал идентификации генетической изменчивости, контролирующей лактацию, может быть проиллюстрирован сравнением генетических отличий, контролирующих значительные различия в выработке молока у крупного рогатого скота Bos taurus и Bos indicus. Соответственно, редактирование генома может позволить интрогрессировать благоприятные аллели, что может иметь большие преимущества в отношении производства молока Bos indicus в тропических регионах мира [46].
Недостатком всех современных инструментов редактирования генома (ZFN, TALEN и CRISPR / Cas9) является вероятность мутаций в нецелевом участке генома [37]. Хотя эти мутации могут и не оказывать влияния на здоровье отдельных животных, они несут потенциальный риск и могут сдерживать широкое использование технологии редактирования генома. В большинстве случаев нецелевые мутации будут либо отбракованы в будущем, если они пагубны или, скорее всего, исчезнут, если они нейтральны. Тем не менее в процессе изменения геномов следует учитывать нецелевое редактирование [37].
Инструменты редактирования генома могут эффективно дополнять существующие методы отбора в молочном скотоводстве. Наиболее востребованный вариант их использования – это приобретение контролируемых свойств за счет изменения единичных генов или локусов, оказывающих большое влияние на фенотип. С помощью информации о ключевых локусах SNP, полученных из молекулярного скрининга, возможно выполнять точные одиночные модификации в геномах животных, используя технологию редактирования генома и непосредственно редактировать эти локусы, чтобы получить генотип с желаемыми качествами [47]. Применение генетического модифицирования или редактирования генома, возможно, будет более простым в случае моногенных аллелей с известными последовательностями. В частности, было предложено использовать редактирование генома для фиксации благоприятных аллелей для признаков, связанных, например, с устойчивостью к болезням [48]. Одним из наиболее очевидных потенциальных применений редактирования генома у сельскохозяйственных животных может быть удаление известных вредных рецессивных аллелей, которые ухудшают рождаемость или здоровье, и в этом смысле восстановить геном после аккумулирования мутаций при разведении животных [49].
Метод редактирования генома позволяет вводить мутации, не оставляя следов, связанных с технологией, что, следовательно, приводит к модификациям генома, которые не поддаются выявлению, поскольку являются неотличимыми от естественных мутаций. Таким образом, используя генетические варианты одного и того же вида, возможно надеяться на принятие этой технологии и уменьшение препятствий к ее внедрению [7, 47].
Потенциальные риски и факторы, ограничивающие использование технологии геномного редактирования
Несмотря на то, что использование технологий редактирования генома может решить многие проблемы молочного скотоводства, необходимо с осторожностью относиться к их применению в связи с их масштабностью и долгосрочностью влияния. В отличие от трансгенных животных, обычно содержащих привнесенные последовательности в геном хозяина, в отредактированном геноме животных изменения, проведенные с высокой точностью и эффективностью, часто свободны даже от следов воздействия используемой технологии [7]. Это требует разработки нормативной политики и стандартов, а также существенных технологий и ресурсов для обеспечения надлежащей регистрации и создания системы отслеживания, воспроизведения и использования этих животных и их продуктов [47, 50]. Даже в случае урегулирования технических и юридических препятствий остаются практические и этические вопросы, касающиеся введения и тиражирования модифицированных или отредактированных генетических вариантов в популяции, самыми важными среди которых остаются вопросы последствий генетических изменений. В связи с этим приобретают особое значение меры предосторожности, включающие в себя как определение и оценку рисков, так и управление ими [10]. Соображения безопасности и сложность этических проблем, связанных с использованием технологий геномного редактирования, следует принимать во внимание задолго до того, как генетически модифицированные животные и продукты, полученные от них, могут выйти на рынок, как, например, при производстве пищевых продуктов или фармацевтических препаратов [50]. Поэтому коммерциализация генетически модифицированных продуктов животного происхождения остается сложным вопросом, касающимся задействованных видов, важности конечного продукта, типа используемой технологии, отсутствия или наличия альтернативных способов достижения цели, вовлеченности этических вопросов и необходимости общественного признания.
Учитывать возможные этические проблемы необходимо и в случае генетических модификаций КРС, направленных на улучшение здоровья вымени коров или качества молока, а также использования коров в качестве биореакторов. Важность привлечения этических вопросов хорошо прослеживается в отношении противодействия повышенной скорости инбридинга, приводящего к ухудшению видовых характеристик или снижению приспособляемости к новым условиям. При этом следует особо выделить огромную разницу между использованием редактирования генома в отдельном лабораторном эксперименте и широким применением в крупномасштабных программах селекции животных [10].
Заключение
Генетические модификации и геномное редактирование рассматривается сейчас в качестве быстрого решения проблем в области селекции животных и их генетики. Появление в нужное время этих технологий может значительно сократить время воспроизводства, снизить его стоимость и быстро увеличить генетическое разнообразие, при значительном повышении его качества. Редактированием генов уже были продемонстрированы значительные улучшения в отношении, например, устойчивости к болезням и изменения других благоприятных характеристик. Кроме того, управление и содержание генетически модифицированного скота может иметь преимущества, связанные с его изменением.
Несмотря на гигантский потенциал генно-инженерных и геномных технологий для развития животноводства будущего, необходимо принимать в расчет, что на сегодняшний день отсутствует полное понимание ожидаемых комплексных изменений в ответ на генетические манипуляции. Поэтому к ним необходимо подходить с осторожностью, ввиду сложностей, связанных с крупномасштабностью и интегрированием в селекционные схемы, рисками принятия обществом и проблемами этического характера. В какой-то момент население планеты не сможет позволить себе роскошь не использовать такие новые технологии и ресурсы, так как риск их не использовать может быть большим [49].
Таким образом, использование этих новых технологий, вместе со способностью создавать гораздо более продуктивные фенотипы при надлежащем управлении, может привести к устойчивому и быстрому улучшению генома и стабильному обеспечению растущих потребностей человека в будущем.
Автор выражает признательность А.В. Бабий за предложения по оформлению работы и коррекцию текста.
Библиографическая ссылка
Бурсаков С.А., Ковальчук С.Н. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ СОВРЕМЕННЫХ ГЕНОМНЫХ И ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В МОЛОЧНОМ СКОТОВОДСТВЕ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2019. – № 9. – С. 22-29;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=12845 (дата обращения: 19.04.2024).