Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

МЕТОД ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ 131I C МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ ДЛЯ РАДИОИММУНОДИАГНОСТИКИ И РАДИОИММУНОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ

Анохин Ю.Н. 1
1 Обнинский институт атомной энергетики- филиал федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования”Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ”
Цель исследования. Предложить метод увеличения эффективности связывания изотопа 131I c противоопухолевыми моноклональными антителами( монАТ) для радионуклидной диагностики и терапии опухолей гематогенной природы. Материалы и методы.. В работе использованы монАТ российского производства ИКО-1 против дифференцировочных антигенов номенклатуры Ia, которые синтезируются клетками эритро- и В-лимфолейкозов. Связывание монАТ с радионуклидом проводили в присутствии препаратов Iodogen или хлорамина-Т. Результаты и их обсуждение.Эффективность связывания радионуклида 131I с монАТ в присутствии окислителя Iodogen составляла 86,5% от введенной в смесь радиоактивности, тогда как аналогичный показатель для хлорамина-Т был в 2 раза меньшим( 43%). Выводы.1)С помощью препарата Iodogen возможно более эффективное связывание радионуклида 131I с монАТ, чем при использовании окислителя хлорамина-Т.2)Использование агента “Iodogen” позволило создать комплекс моноклональных антител с радионуклидом 131I с лучшими характеристиками накопления в опухолевом очаге в сравнении с аналогичным комплексом, полученным по методу “хлорамин-Т”.
Iodogen
моноклональные антитела
радиоиммунодиагностика
радио-иммунотерапия
опухоли
радионуклид
направленный транспорт
связывание
1. Анохин Ю.Н, Норец Т.А., Деденков А.Н. Моноклональные антитела в радионуклидной диагностике и терапии опухолевых заболеваний ( Обзор)// Мед.радиология, 1985, №6, с. 72-78
2. Анохин Ю.Н. Меченые антитела для радиоизотопной диагностики и терапии опухолевых заболеваний. //1-й Евразийский конгресс по мед.физике, Москва, 2001, №11, с.10
3. Анохин Ю.Н. Меченные радиоизотопами антитела для диагностики и терапии онкологических заболеваний у человека. // Сб.научн.трудов междунар.конф. Биохимия- медицине Махачкала, 2002, с.212-214
4. Анохин Ю.Н. Использование нанотехнологий и наноматериалов для визуализации и терапии злокачественных опухолей.// Тез.докл.научн.сессии НИЯУ МИФИ, Москва, 2010, т.3, стр 67
5. Анохин Ю.Н. Использование нанотехнологий и наноматериалов для визуализации и терапии злокачественных опухолей.// Труды научн. сессии НИЯУ МИФИ-2010 в 6 томах, том 3, Фундамент пробл.науки,М, НИЯУ МИФИ,Москва, 2010, стр.221-224
6. Абакушин Д Н, Абакушина Е.В., Анохин Ю.Н. Поиск новых мишеней для радиоиммунотерапии онкологических заболеваний Онкология 21-го века : от научных исследований – в клиническую практику. //Мат.8-го Всероссийского съезда онкологов, т. 3, стр.1150, 11-13 сентября 2013,Санкт-Петербург
7. Анохин Ю.Н., Норец Т.А., Петрова Г.А., Ендолов В.В., Трофимова М.В., Новиков В.В. Избирательное накопление меченных 131-йодом моноклональных антител ИКО-1 в ткани мышиного лимфолейкоза L-1210 // Мед. Радиология. 1988. №1. С. 31-33.
8. Cheson B.D. Radioimmunotherapy of non-Hodgkin lymphomas // Blood.2003. № 101.P. 391–398.
9. Kaminski M.S., Estes J., Zasadny K.R., Francis I.R., Ross C.W., Tuck M., Regan D., Fisher S., Gutierrez J., Kroll S., Stagg R., Tidmarsh G., Wahl R.L. Radioimmunotherapy with iodide (131)I tositumomab for relapsed or refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma: updated results and long-term follow-up of the University of Michigan experience // Blood. 2000. N 96. P. 1259–1266
10.Paganelli G, Chinol M. Radioimmunotherapy: is avidin-biotin pretargeting the preferred choice among pretargeting methods? // Eur. J .Nucl. Med .Mol. Imaging. 2003.Vol. 30. P. 772– 776.
11. van Schaijk F.G., Broekema M., Oosterwijk E., van Eerd J.E.M., McBride B.J., Goldenberg D.M., Corstens F.H.M., Boerman O.C. Residualizing Iodine Markedly Improved Tumor Targeting Using Bispecific Antibody-Based Pretargeting . J. Nucl. Med. 2005; 46:1016–1022
12. Visser G.W., Klok R.P., Klein Gebbinck J.B., ter Linden T, van Dongen G.V., Molthoff C.V. Optimal Quality 131I-Monoclonal Antibodies on High-Dose Labeling in a Large Reaction Volume and Temporarily Coating the Antibody with IODO-GEN. J. Nucl. Med. 2001; 42:509–519

Введение

В последние 15-20 лет в развитых странах интенсивно внедряется направление лечения онкологических заболеваний с использованием меченых антител –радиоиммунотерапия (далее-РИТ). В клинической практике в развитых странах с успехом используются несколько типов радиофармпрепаратов (далее РФП) на основе противоопухолевых моноклональных антител ( алее-монАТ)[8,11].Терапевтическа эффективность этого нового класса РФП во многих случаях очень высока и обусловлена целенаправленной доставкой источника ионизирующего излучения(радионуклида) в опухоль антителами, взаимодействующими с мишеневыми антигенами на клетках опухоли.Помимо этого, сами антитела могут обладать цитотокси-ческим действием на опухолевые клетки. Сейчас уже широко используется в научной литературе термин “таргетная терапия” для обозначения особого типа лечебного действия препаратов, созданных на основе антител, их фрагментов, пептидов[8,10,11]. Тем самым подчеркивается целенаправленный, ”адресный” транспорт и взаимодействие введенного( внутривенно или эндо-лимфатически) во внутреннюю среду препарата с мишеневыми антигенами на клетках.

Важным аспектом лечебной эффективности РФП является количество связанного с носителем радиоактивности, обеспечивающее радиотоксический эффект на клетки в патологическом очаге [9,11,12]. МонАТ чрезвычайно избирательны как транспортеры для доставки в опухоль радионуклида. Задача разработчиков радиотерапевтических комплексов на основе монАТ состоит в том, чтобы создать необходимую для достижения лечебного эффекта удельную радиоактивность РФП.

В этом плане хорошим объектом служит давно используемый в клинической и экспериментальной медицине 131I, обладающий приемлемыми параметрами как для диагностических, так и лечебных целей ( гамма-излучатель с излучением γ-квантов с энергиями от 0,08 до 0,723 МэВ) -и бета-излучатель (β-частицы с максимальной энергией 0,807 МэВ) со сравнительно коротким временем полураспада- 8, 02 сут.).Для его связывания с молекулами антител( иммуноглобулинов) традиционно используется хлорамин-Т (натриевая соль N-хлор-р-толуолсульфонамина). Получаемые комплексы монАТ с 131I(131I-монАТ) обладают удовлетворительными характеристиками для радиоиммунодиагностики [1-6,9]. Однако, необходимость включения в молекулу иммуноглобулина( антитела) высокой дозы радиоактивности для целей радиоиммунотерапии не позволяет с успехом использовать хлорамин-Т, поскольку это приводит к значительной потере иммунореактивности монАТ после процедуры мечения.

В связи с этим, в работе проведено исследование эффективности связывания 131I с монАТ и степень сохранения их иммунореактивности после процедуры радиомечения с использованием препарата “Iodogen”, зарекомендовавшим себя как активный окислитель.

Материалы и методы

Процедура радиомечения монАТ. Моноклональные антитела серии ИКО-1 направлены против Ia-антигенов, экспрессируемых на клетках эритро- и В-лимфолейкозов .Их титр в тесте иммунофлуоресценции составлял 1:100.Лиофилизи-рованные с бычьим сывороточным альбумином монАТ растворяли в фосфатном буфере( рН 7,4) до концентрации 10мг/мл. К 2 мл раствора Na131I в фосфатном буфере( 37 Мбк/мл) добавляли 2 мл раствора монАТ( 1 мг/мл) и вносили в смесь 500 мкг реактива “Iodogen”( 1,3,4,6-тетрахлор-3-альфа,6-альфа-дифенилгликоурил)(Pierce,Beijerland , Нидерланды).

В варианте сравнения, к смеси 131I с монАТ добавляли 200 мкг реактива “ хлорамин-Т” (натриевая соль N-хлор-р-толуолсульфонамина). В обоих вариантах реакции продолжа-лись 5 мин, после чего блокировались добавлением в смеси 100 мкг аскорбиновой кислоты.

Отделение фракции меченых антител от примесей. Для разделения меченных 131I- монАТ и радиоактивных примесей раствор элюировали методом жидкостной хроматографии на колонках с носителем Sephadex G-15(Pharmacia,Швеция); элюэнтом был фосфатный буфер. Спектр элюируемых фракций монАТ и примесей с радиоактивной меткой определяли на анализаторе “Honeywell”( Великобритания).Помимо этого, анализ чистоты фракции меченных антител проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинах с носителем Silufol UV-254.

Тесты для определения иммунной реактивности антител. Иммунологическую реактивность монАТ до и после процедуры связывания с радионуклидом исследовали в цитотоксическом тесте ин витро в присутствии комплемента морской свинки. Клетками-мишенями в тесте служили лимфоциты лимфатических узлов мышей а также клетки опухолевых линий мышиного лимфолейкоза L1210 и гемоцитобластоза La, экспресси-рующие мишеневый антиген Ia. Цитотоксичность монАТ определяли по интенсивности выхода красителя “трипанового синего”(Gibco, Шотландия).Опухолевые линии мышиных лейкозов получены из лаборатории экспериментально-биологических моделей РОНЦ РАМН. Суспензии клеток доводили до концентрации 108/мл, вносили в 96-луночные планшеты для культивирования клеток( Costar,США) и добавляли в лунки антитела, меченные 131I по методу “Iodogen” или методом “ хлорамин-Т “. В качестве контроля в лунки планшет вносили неиммунные иммуноглобулины( IgG-класса).

После 30 мин культивирования в CO2-инкубаторе в лунки добавляли краситель “трипановый синий”, через 10 мин клетки отделяли от надосадочной жидкости центрифугированием(1500 об/мин) и определяли интенсивность окрашивания раствора на спектрофотометре, тем самым оценивая жизнеспособность клеток-мишеней по выходу из них красителя.

Исследование биораспределения радиомеченных монАТ в органах животных. В опытах использовали мышей гибридной линии BDF1( DBA/2 x C57Bl/6)F1 в возрасте 3 мес, массой около 20 г. За 6 сут до проведения опытов животным вводили внутрибрюшинно по 5.106 клеток лимфолейкоза L1210. Для исследований отбирали мышей с солидными формами лейкоза, локализованными на брыжейке кишечника. В день исследования, животным проводили блокаду щитовидной железы питьевым раствором 1,5% иодистого калия. После этого им вводили внутривенно по 0,2 мл раствора меченных монАТ с удельной активностью 1 МБк/ мл.В качестве контроля другой группе животных вводили внутривенно 0,2 мл неиммунных мышиных иммуноглобулинов IgG класса, меченных 125I.

Через 24 ч мышей забивали, выделенные органы подвергали радиометрии в дифференциальном режиме для 125 I и I 131 в колодезном счетчике. Для определения введенной дозы радиоактивности использовали 0,2 мл раствора меченных антител.

an4.wmf

Результаты

После процедуры связывания радионуклида с молекулами иммуноглобулинов было проведено отделение( выделение) фракции связавшихся с радиоактивной меткой антител от различных видов примесей и свободного радионуклида. Использовали метод жидкостной хроматографии с подключением счетчика-радиометра для определения уровней радиоактивности различных элюированных фракций. Результаты этого исследования приведены на рис.1. Они свидетельствуют о том, что основная часть радионуклида связалась с иммуноглобулиновой фракцией( антителами). При этом, в случае использования агента “Iodogen” эффективность связывания составила 86,5 %, тогда как при использовании агента” хлорамин-Т” она была около 43%.Лишь малая доля радиоактивности приходилась на примесные фракции( около 13%).

an1.tif

Рис.1.Качественный анализ фракции РФП 131-I ИКО-1 (жидкостная хромато-графия) после процедуры мечения с реагентом “Iodogen”

(Пик 1 – радиоактивные примеси(13%; 1,5 мин); пик 2 – 131I -ИКО-1,( 86,5%, 5 мин)

Анализ чистоты фракций меченных антител был подтвержден и методом тонкослойной хроматографии.

Следующим этапом нашей работы был анализ иммунологической реактивности противоопухолевых антител после проведения процедуры радиомечения. Для этого были исследованы иммунологические свойства антител ИКО-! в тесте комплемент-зависимой клеточной цитотоксичности против различных клеток-мишеней, в том числе и против опухолевых клеток, экспрессирующих в повышенной концентрации Ia-антигены. И снова, тесты были проведены в сравнительном аспекте для антител, меченных по методу “ Iodogen” или методу ”хлорамин-Т”. Результаты проведенных исследований представлены в табл.1.

Они свидетельствуют о том, что после проведения процедуры радиомечения антитела теряют некоторую долю иммунологической реактивности. При малых разведениях сыворотки( от 1:4 до 1:32) снижение реактивности составляет 20-25%, тогда как при больших разведениях она более выражена( до 75-80 %). По-прежнему, результаты теста более удовлетворительные для реагента”Iodogen” в сравнение с методом”хлорамин-Т”.

Таблица 1

Иммунологическая реактивность монАТ ИКО-1 после связывания с радионуклидом 131I

an2.tif

Следующим этапом было исследование специфичности накопления меченных радионуклидом противоопухолевых антител в органах и тканях лабораторных животных с опухолями в экспериментах ин виво. Схема проведения этой части экспериментов представлена в разделе“Материалы и методы”.Результаты проведенной работы представлены на рис.2.Обращает на себя внимание высокое накопление радиофармпрепарата в ткани опухоли в сравнении с любым из исследованных органов. При этом, избирательно накапливались антитела в опухолевом очаге ,меченные как по методу”Iodogen”, так и по методу” хлорамин-Т”.Но и здесь, результаты биораспределения радиофармпрепаратов, приготовленных по методу”Iodogen”, были предпочтительные в сравнении с препаратами метода “хлорамин-Т”.

an3.tif

Рис.2. Накопление меченных радионуклидами моноклональных антител в органах мышей с опухолью. В каждой экспериментальной группе использованы не менее 3 животных(n=3). Данные представлены в виде средних величин и средне - квадратичных отклонений от них ( М_+ m)

Ранее проведенные нами исследования по направленному транспорту радиофармпрепаратов на основе моноклональных противоопухолевых антител в опухолевый очаг показали весьма удовлетворительные результаты.[1-5].Однако, довольно высокая доля накопления препарата в крови и в печени заставила искать более эффективные методы связывания радионуклида с антителами с сохранением возможно большей иммунореактивности после радиомечения [7].. Тем самым было возможно снизить неспецифический компонент связывания антител в не-мишеневых органах. Эти поиски привели нас к реагенту “Iodogen”, который оказался не только более активным окислителем, но и позволял сохранить достаточно высокий уровень иммунореактивности антител после коньюгации с радионуклидом[8,12].. Результаты экспериментов показали снижение неспецифического компонента накопления радиофармпрепарата в таких органах, хотя различия при использовании обоих методов связывания антител с радионуклидом недостоверны.

Выводы

1) С помощью препарата Iodogen возможно более эффективное связывание радионуклида 131I с монАТ, чем при использовании окислителя хлорамина-Т.

2) Иммунологические свойства коньюгата на основе монАТ изменяются после процедуры радиомечения примерно одинаково для обоих окислителей .Такие характеристики являются важными при создании РФП с высокой удельной радиоактивностью для радионуклидной диагностики и радиоиммунотерапии онкологических заболеваний.

3) Использование агента “Iodogen” позволило создать комплекс моноклональных антител с радионуклидом 131I с лучшими характеристиками направленного транспорта в опухолевый очаг в сравнении с аналогичным комплексом, полученным по методу “хлорамин-Т”.


Библиографическая ссылка

Анохин Ю.Н. МЕТОД ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ 131I C МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ ДЛЯ РАДИОИММУНОДИАГНОСТИКИ И РАДИОИММУНОТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2014. – № 8-2. – С. 29-34;
URL: http://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=5577 (дата обращения: 09.03.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074