Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ОСОБЕННОСТИ ВРОЖДЕННОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМ ОСТЕОМИЕЛИТОМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МИКРОБНОГО ПЕЙЗАЖА

Кузнецова Е.И. 1 Розова Л.В. 1
1 ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова Минздрава РФ»
В дооперационном периоде обследовано 52 пациента со свищевой формой хронического посттравматического остеомиелита нижних конечностей. Были проанализированы результаты микробиологического исследования патологического материала, фагоцитарно – метаболический статус нейтрофилов периферической крови. Показано, что основным возбудителем является S. aureus, который выделяется как в монокультуре, так и в ассоциации с другими микроорганизмами, а увеличение количества штаммов в микробных ассоциациях усиливает фагоцитарно – метаболическую активность нейтрофилов, а также способствует активации процесса образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.
остеомиелит
Staphylococcus aureus
фагоцитарная активность нейтрофилов
нейтрофильные внеклеточные ловушки
миелопероксидаза
1. Бухарин О.В., Валышев А.В. Микробные ингибиторы лизоцима / О.В. Бухарин, А.В. Валышев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2006. – № 4. – С. 8–12.
2. Винник Ю.С. Хронический остеомиелит: диагностика, лечение, профилактика / Ю.С. Винник, Н.М. Маркелова, А.А. Шагеев // Сибирское медицинское обозрение. – 2009. – № 6. – С. 12–15.
3. Гайдаш И.С. Микробиологический спектр условно-патогенных бактерий – возбудителей посттравматических остеомиелитов / И.С. Гайдаш, В.В. Флегонтова, С.В. Бирюкова и др. // Ортопедия, травматология и протезирование. – 2000. – № 2. – С. 89–92.
4. Кузнецова Е.И. Функционально – метаболический статус нейтрофильных фагоцитов у пациентов с остеомиелитом длинных трубчатых костей / Е.И. Кузнецова, М.В. Чепелева, Н.М. Клюшин, С.И. Бурнашов // Сибирский научный медицинский журнал. – 2015. – № 1. – С. 65–70.
5. Науменко З.С. Динамика изменения лизоцимной активности и содержание лактоферрина у больных хроническим остеомиелитом / З.С. Науменко, И.В. Шипицина, Л.В. Розова // Клиническая лабораторная диагностика.– 2013. – № 6. – С. 16–18.
6. Пинегин Б.В. Нетрофилы: структура и функция / Б.В. Пинегин, А.Н. Маянский // Иммунология. – 2007. – № 6. – С. 374–382.
7. Розова Л.В. Изменение видового состава микрофлоры у больных хроническим остеомиелитом в процессе лечения // Гений ортопедии.- 2008. – № 2. – С. 92–95.
8. Слободчикова С.В. Влияние антител и цитокинов на эффективность фагоцитоза Staphylococcus aureus: Автореф. дис… канд. мед, наук. – Пермь, 2014. – 122 с.
9. Liu G.Y. Staphylococcus aureus golden pigment impairs neutrophil killing and promotes virulence through its antioxidant activity / G.Y. Liu, A. Essex, J.T. Buchanan, V. Datta, H.M. Hoffman, J.F. Bastian, J. Fierer, V. Nizet // The Journal of Experimental Medicine. – 2005. Vol. 202, № 2. – P. 209–215.
10. Wagner C. Post-traumatic osteomyelitis: analysis of inflammatory cells recruited into the site of infection / C. Wagner, K. Kondella, T. Bernschneider et al. // Shock. – 2003. – Vol. 20, № 6. – P. 503–510.

Проблема лечения ортопедо-травматологической патологии, осложненной хронической гнойной инфекцией, остается актуальной до настоящего времени.

Остеомиелит диагностируется после открытых переломов в 3–24 % наблюдений и в 1–7 % после оперативного лечения закрытых переломов. При этом рецидивы остеомиелита отмечаются у 20–30 % больных, что приводит к функциональной неполноценности конечности в 10,3–57 % наблюдений [2, 10].

Возникновение, развитие и течение гнойного процесса определяется сочетанием многих факторов, среди которых ведущим является взаимодействие защитных сил организма и проникших микробов. В настоящее время основными возбудителями хронического посттравматического остеомиелита являются монокультуры и ассоциации Staphylococcus aureus с грамотрицательными микроорганизмами [3].

Выявлена связь воспалительного процесса при остеомиелите с динамикой показателей естественной резистентности в тканях [5].

Влияние хронической инфекции на фагоцитарную активность нейтрофилов и лизоцимную активности сыворотки крови при лечении методом чрескостного остеосинтеза остается малоизученным.

Целью настоящей работы явилась оценка неспецифического звена иммунитета у больных с хроническим остеомиелитом нижних конечностей в зависимости от выявленной микрофлоры.

Материалы и методы исследования

В дооперационном периоде обследовано 52 пациента со свищевой формой хронического посттравматического остеомиелита нижних конечностей в стадии обострения, находившихся на хирургическом лечении в клинике РНЦ «ВТО» им акад. Г.А. Илизарова в период с 2011 по 2013 гг. Возраст обследованных больных находился в пределах от 20 до 55 лет, длительность заболевания варьировала от 3 до 15 лет.

Были проанализированы результаты микробиологического исследования патологического материала. В качестве объекта исследования в работе было использовано отделяемое из ран, свищей (в дооперационном периоде). Микробиологические исследования выполняли традиционным методом посева на плотные питательные среды. Идентификация бактерий проводилась как в соответствии с общепринятыми рекомендациями, так и при помощи баканализатора «WalkAway-40 Plus» («Siemens») с использованием микротест – систем. Анализ данных исследуемых штаммов осуществлялся при помощи аналитической компьютерной программы WHONET 5,6.

Применялась стандартная методика изучения фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН), основанная на количественном определении поглотительной и переваривающей способности нейтрофилов по отношению к микробной тест – культуре (Staphylococcus epidermidis штамм № 9198 НИИЭМ). Рассчитывались следующие показатели ФАН: фагоцитарный показатель (ФП, %), фагоцитарное число (ФЧ, %); количество активных фагоцитов (КАФ,(109/л)); абсолютный фагоцитарный показатель (АФП, (109/л)). Кислородзависимую метаболическую активность нейтрофильных гранулоцитов оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ – тест) по методу Park, в двух вариантах: спонтанном и стимулированном. Лизосомальную активность нейтрофилов определяли, используя цитохимическое исследование клеток. Активность миелопероксидазы (МП) определялась по Грехему – Кнолю. Уровень лизосомальных катионных белков (КБ) цитоплазмы устанавливали в реакции с бромфеноловым синим. Уровень МП и КБ выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Для подсчета нейтрофильных ловушек использовали мазки крови, окрашенные по Романовскому – Гимза. Учет ФАН производился при помощи световой микроскопии под иммерсией, исходя из 100 подсчитанных нейтрофилов.

Оценку лизоцимной активности сыворотки крови (ЛАСК) проводили по методике Стогний В. И. и соавт. Забор крови осуществлялся из локтевой вены натощак.

В качестве контрольных использовались иммунологические показатели 21 относительно здоровых добровольца из числа сотрудников в возрасте от 25 до 55 лет. Все лица, участвовавшие в исследовании дали информированное согласие на публикацию данных, полученных в результате исследования, без идентификации личности. На проведение клинических исследований получено разрешение комитета по этике ФГБУ «РНЦ» «ВТО им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России».

Полученные данные обрабатывались с помощью методов непараметрической статистики с использованием U-критерия Вилкоксона и были представлены в виде М ± m. Различия считались достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

По результатам микробиологического исследования пациенты были распределены на 2 группы. В I группе пациентов (n = 27) микробный пейзаж раневого отделяемого представлен монокультурой – S. aureus, во II группе (n = 25) – двух – трех компонентными ассоциациями микроорганизмов.

В ассоциациях микроорганизмов выявлен следующий видовой состав: стафилококки – S. aureus, S. hominis, S. epidermidis, S. warneri; стрептококки – Streptococcus intermedius, грамотрицательные микроорганизмы – Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus; анаэробные бактерии – Finegoldia magna, Peptostreptococcus asaccharolyticus [рисунок].

Анализ полученных данных показал следующее: нейтрофилы в обеих группах независимо от микробного пейзажа показали высокую фагоцитарную активность (р ≤ 0,01) по сравнению с контрольной группой (табл. 1).

Однако, наиболее выраженные изменения со стороны показателей ФАН отмечались в группе пациентов со смешанной микрофлорой в раневом отделяемом. У данной группы больных большинство исследованных показателей (ФП, ФЧ, КАФ, АФП) были достоверно выше, чем в контроле (табл. 1). В группе пациентов, у которых из ран высевались микробные ассоциации, наибольшую активность проявили кислородзависимые факторы бактерицидной активности нейтрофилов – миелопероксидаза и кислородные радикалы (НСТ – тест). Величина НСТ – теста в обоих вариантах у пациентов с ассоциациями достоверно превышала контрольные значения. Та же самая тенденция наблюдалась и в отношении кислородзависимой лизосомальной активности нейтрофилов – МП. Данный показатель во второй группе имел достоверные отличия не только с контролем, но и с первой группой, где в ранах превалировал золотистый стафилококк.

kuiz1.tif

Микробный пейзаж раневого отделяемого у больных II группы

Таблица 1

Показатели неспецифической резистентности у больных хроническим остеомиелитом в зависимости от выявленной микрофлоры

Показатель

I группа – S. aureus

II группа – микробные ассоциации

Контрольная группа

ФП ( %)

87,5 ± 1,70

91,6 ± 1,13+

71,0 ± 1,27

ФЧ (у.е.)

9,4 ± 0,65+

9,7 ± 0.64+

7,3 ± 0,18

КАФ(109/л)

4,4 ± 0,48++

5,2 ± 0,70++

2,3 ± 019

АФП(109/л)

45,2 ± 4,46++

51,0 ± 4,11++

24,0 ± 1,99

НСТ спонт. ( %)

7,7 ± 1,52

8,4 ± 1,29+

5,6 ± 0,32

НСТ стим. ( %)

71,0 ± 4,11+

76,0 ± 4,45+

54,0 ± 1,87

МП(СЦК)

2,0 ± 0,11

2,5 ± 0,10*+

2,1 ± 0,05

КБ (СЦК)

2,3 ± 0,06

2,3 ± 0,10

2,0 ± 0,04

ЛАСК ( %)

83,3 ± 1,2

83,2 ± 2,7

83,8 ± 0,2

НВЛ ( %)

5,1 ± 0,63++

5,7 ± 1,42++

1,0 ± 0,2

Примечание. + – р ≤ 0,05, ++ – р ≤ 0,01 – относительно показателей контрольной группы; * – р ≤ 0,05 – относительно показателей I группы.

 

Кислороднезависимая лизосомальная активность нейтрофилов (КБ, ЛАСК) в обеих исследованных группах оставалась в пределах значений показателей контроля.

В обеих группах больных наблюдалось усиление недавно открытого механизма внеклеточного киллинга – образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ). Содержание НВЛ у больных с гнойной инфекцией значительно превысило контрольные значения. По количеству образуемых нейтрофильньных ловушек достоверных различий между I и II группой не зафиксировано.

Интересные данные были получены при разделении II группы на подгруппы:

1) двухкомпонентные ассоциации – в состав которых входили стафилококки (в основном S. aureus) и грамотрицательные микроорганизмы (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens);

2) трехкомпонентные ассоциации – в их составе было выявлено не менее трех штаммов различных бактерий, обязательно присутствовал S. aureus, а так же встречались грамотрицательные бактерии (Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumannii, Bacillus cereus) и прочие микроорганизмы (Streptococcus intermedius, S. warneri, Finegoldia magna, Peptostreptococcus asaccharolyticus).

В обеих подгруппах наблюдались однонаправленные изменения показателей ФАН – эффекторная и метаболическая функции нейтрофилов находились на высоком уровне в сравнении с контролем (табл. 2).

Наибольшие достоверные отличия выявлены в отношении показателей лизосомальной активности нейтрофилов (МП, КБ): у больных с 2 – х компонентными ассоциациями величина данных показателей значительно (р ≤ 0,01) превышала контрольные значения.

Для обеих подгрупп была характерна высокая активность внешнего киллинга (образование НВЛ). Однако, у пациентов с 3 – х компонентными микробными ассоциациями способность к образованию ловушек была более выражена, чем в контроле и во 2 – й подгруппе.

По нашим данным, у больных остеомиелитом золотистый стафилококк высевался не только в монокультуре, а также присутствовал в большинстве ассоциаций наряду с грамотрицательной микрофлорой. Наши данные полностью согласуются с ранее проведенными исследованиями и с исследованиями других авторов [3, 7].

Важным этапом процесса фагоцитоза является киллинг поглощённых бактерий в фагоцитирующих клетках, обеспечивающийся кислородзависимыми и кислороднезависимыми механизмами, которые играют ведущую роль в уничтожении поглощенных микроорганизмов, и, в конечном итоге, в защите макроорганизма от инфекций [6].

Эффективность этих механизмов бактерицидности зависит от свойств микроба и условий его контакта с фагоцитом. Известно, что золотистый стафилококк, так и грамотрицательные симбионты, находящиеся с ним в выделенных ассоциациях, обладают рядом факторов, которые разрушают активные формы кислорода, а также обладают атилизоцимной активностью и устойчивостью к катионным белкам. При фагоцитозе изменяется экспрессия многих генов золотистого стафилококка, в том числе повышается синтез токсинов [1, 9].

Таблица 2

Показатели неспецифической резистентности у больных хроническим остеомиелитом в зависимости от состава микробных ассоциаций

Показатель

2-х компонентные ассоциации

3-х компонентные

ассоциации

Контрольная

группа

ФП ( %)

89,0 ± 0,99++

94,2 ± 0,63++

71,0 ± 1,27

ФЧ (у.е.)

8,8 ± 0,92

10,7 ± 0,63+

7,3 ± 0,18

КАФ (109/л)

6,2 ± 1,03++

4,1 ± 0,24+

2,3 ± 019

АФП (109/л)

55,3 ± 7,82++

46,8 ± 2,32+

24,0 ± 1,99

НСТ спонт. ( %)

7,8 ± 1,65

9,2 ± 2,25+

5,6 ± 0,32

НСТ стим. ( %)

80,4 ± 3,81++

70,5 ± 7,71+

54,0 ± 1,87

МП(СЦК)

2,7 ± 0,06++

2,4 ± 0,13

2,1 ± 0,05

КБ (СЦК)

2,4 ± 0,13+

2,1 ± 0,08

2,0 ± 0,04

НВЛ ( %)

3,2 ± 0,40

8,2 ± 1,44*++

1,0 ± 0,2

Примечание. * – р ≤ 0,05 относительно показателей больных с 2 – х компонентными ассоциациями; + – р ≤ 0,05, ++ – р ≤ 0,01 показателей контрольной группы.

 

Как показали наши исследования, фагоцитарный потенциал нейтрофилов у больных остеомиелитом был довольно высок, особенно кислородзависимые механизмы киллинга. Несмотря на это, заболевание продолжало прогрессировать [4].

Можно предположить, что при наличии достаточного количества бактерицидных факторов, нейтрофилы работают на пределе своих возможностей. Однако, микробы довольно легко разрушают большую часть образующихся активных форм кислорода и успешно инактивируют лизоцим и катионные белки [8].

Несмотря на это, нейтрофильные фагоциты пытаются до конца использовать весь свой арсенал для борьбы с инфекцией. Вторым защитным механизмом нейтрофилов является выделение содержимого гранул во внеклеточное пространство – образование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Наибольший стимулирующий эффект на образование НВЛ оказали 3 – х компонентные ассоциации, тогда как большей киллинговой активностью, скорее всего, обладали НВЛ у пациентов с 2 – х компонентными ассоциациями. У данной группы в фагоцитах содержалось большее количество лизосомальных ферментов.

Выводы

Таким образом, проведенные лабораторные исследования показали, что у больных с хроническим посттравматическим остеомиелитом длинных трубчатых костей основным возбудителем является S. aureus, который выделяется как в монокультуре, так и в ассоциации с другими микроорганизмами. Показано, что ФАН меняется в зависимости от видового состава микрофлоры. Проведенное сравнительное исследование позволило установить, что увеличение количества штаммов в микробных ассоциациях усиливает фагоцитарно – метаболическую и ловушкообразующую активность нейтрофилов. Комплексное исследование микробного пейзажа и факторов врожденного иммунитета может быть использовано для диагностики течения инфекционного процесса.


Библиографическая ссылка

Кузнецова Е.И., Розова Л.В. ОСОБЕННОСТИ ВРОЖДЕННОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМ ОСТЕОМИЕЛИТОМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МИКРОБНОГО ПЕЙЗАЖА // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 7-2. – С. 234-237;
URL: http://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=6999 (дата обращения: 07.03.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074