Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ЭФФЕКТ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Михайличенко В.Ю. 1 Столяров С.С. 1
1 Медицинская академия имени С.И. Георгиевского Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» Министерства образования и науки Российской Федерации
В статье описано моделирование и течение аллоксанового сахарного диабета у крыс. Авторами отмечены биохимические, гормональные сдвиги в организме животных идентичных изменениям в организме человека с сахарным диабетом 1 типа. В частности происходит снижение концентрации инсулярных и повышение контринсулярных гормонов, данный процесс сопровождается повышением индекса атерогенности крови. При гистологическом исследовании отмечается апоптоз островков Лангерганса поджелудочной железы. Трансплантация культур клеток поджелудочной железы 3 месячного кролика позволяет нормализовать уровень гликемии, достичь нормализации показателей контринсулярных гормонов. В поджелудочной железы крыс отмечается образование новых островков Лангерганса из эпителия протоков поджелудочной железы. В связи с реакцией отторжения данный эффект ослабевал к 60 суткам, что приводило к приближению показателей крови к первоначальным цифрам.
аллоксановый диабет
трансплантация
культура клеток поджелудочной железы
1. Жилюк В.И. Значение эндотелиотропных и антиагрегантных свойств в нейропротективном действии прамирацетама при аллоксановом диабете / В.И. Жилюк, В.И. Мамчур, А.Э. Левых // Патологія. 2010. №1. С. 56-58.
2. Михайличенко В.Ю. Хирургическое лечение экспериментального сахарного диабета / В.Ю. Михайличенко // Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2002. Т. 3, №3. С. 465-467.
3. Можейко Л.А. Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть I. аллоксановый диабет / Л.А. Можейко // Журнал гродненского государственного медицинского университета. 2013. № 3. С. 26-29.
4. Трансплантация культуры клеток поджелудочной железы при аллоксановом диабете (сообщение 1) / О.И. Миминошвили, В.Ю. Михайличенко, А.Г. Попандопуло и др. // Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2003. Т.4. №3. С. 530-533
5. Черкасова О.П. Активность 11b-гидроксистероиддегидрогеназы в надпочечниках, печени и почках крыс с экспериментальным диабетом / В.Г. Селятицкая, Н.А. Пальчикова, Н.В. Кузнецова, О.П. Черкасова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2013. №8. С. 26-28.

Несмотря на значительные успехи достигнутые в современной диабетологии, ряд вопросов остаются открытыми, что требует дальнейшего изучения данной патологии и совершенствования путей ее коррекции. Большое значение для выявления вопросов патогенеза, клиники, лечения и профилактики заболевания имеет экспериментальная диабетология. Экспериментальные модели сахарного диабета позволяют получить ценные сведения не только для понимания патофизиологии заболевания, но и механизма антидиабетического действия различных препаратов с целью направленного их применения [1, 2, 4]. Аллоксановая модель сахарного диабета у животных является оптимальным на современном уровне развития экспериментальной диабетологии, т.к. полностью соответствует патогенезу сахарного диабета у человека [2, 3, 5].

Исследования проводились на 40 белых половозрелых лабораторных крысах самцах массой 200-250г, содержащихся в обычных условиях вивария. Сахарный диабет вызывали путем подкожного введения раствора аллоксана тетрагидрата из расчета 20 мг на 100 г массы тела, предварительно 2 суток голодавшим животным. Раствор аллоксана готовили путем разведения кристаллического субстрата Alloxan Tetrahydrate фирмы Fluka-Sigma (Германия) в стерильной дистиллированной воде. После растворения кристаллов вещества, стерильность раствора добивались путем пропускания его через мембрану Millex-GV с фильтром 0,22 μm фирмы MILLIPORE (Франция) и помещали в стерильные закатанные флаконы.

Материалом для приготовления культуры клеток поджелудочной железы служила поджелудочная железа 3 месячного кролика породы шиншилла. В стерильных условиях экспериментального операционного блока у кролика под внутримышечным наркозом Ketamine+Xylazine в пропорции 40+7,5 мг/кг, выполняли верхнесрединную лапаротомию, мобилизовали поджелудочную железу, пунктировали главный проток поджелудочной железы кролика и вводили 0,25% раствор трипсина. После чего железу немедленно вынимали из организма животного и помещали в стерильный раствор среды S 199 с антибиотиком и передавали для дальнейшей обработки в Лабораторию клеточного и тканевого культивирования ИНВХ им.В.К. Гусака.

Биохимические показатели крови определяли с помощью стандартных наборов «Lachema» (Czech republic). Для исследования гормонального статуса кровь забирали в количестве 5 мл в условиях основного обмена утром натощак. Немедленно после взятия крови ее переливали из шприца в стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 мл. Предварительно в пробирку добавляли 0,5мл консервирующего раствора и охлаждали ее на ледяной бане. Кровь центрифугировали в течение 30 мин с ускорением не менее 3000g при температуре +40С на рефреджираторной центрифуге К-23 (Германия). Полученную плазму тубировали в заранее промаркированные пластиковые тубы типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл, в которых хранили (не более 3-4 недель) при температуре -700С. Определение содержания инсулина, кортизола, тироксина и трийодтиронина, тестостерона проводили радиоиммунологическим методом с использованием стандартных коммерческих наборов реактивов фирмы “Immunotech” (Чехия. Статистическую обработку полученных данных выполняли на компьютере Pentium V с помощью программ «Microsoft Excel 10», «Statistica 6.0».

После введения диабетогенных доз аллоксана наблюдалось несколько фаз изменений сахарной кривой в крови: первая фаза – гипергликемическая, достигающая максимума в течение первых 2-4 часов; вторая – гипогликемическая, которая в основном проявлялась на протяжении 15-24 часов, и наконец третья фаза – фаза стойкой гипергликемии.

Первые признаки диабета проявлялись в виде резкого увеличения суточного потребления воды (более 120 мл), полифагией, полиурией, гипергликемией, резкой потери в весе, выпадении волосяного покрова. В разные сроки эксперимента развивались трофические язвы голени, гангрена с самоампутацией хвоста. Около 15 % животных погибло в результате гипергликемической или гипогликемической комы в разные сроки развития аллоксанового диабета.

Изменение концентрации инсулина крови определяли с помощью радиоиммунологического анализа с использованием стандартных коммерческих наборов реактивов фирмы “Immunotech” (Чехия) в норме – 4,8+0,3; 1 сутки – 35,6+0,25; 3 сутки – 12.4+0,23; 21 сутки 2,2+0.27; 60 сутки – 2,1+0,31 мкМЕ\мл при р<0,05. В первые сутки развития заболевания отмечается прирост концентрации контринсулярных гормонов: тироксина и кортизола, снижение содержания трийодтиронина и тестостерона. К 7-11 суткам отмечается понижение концентрации общего трийодтиронина и общего тироксина, снижение кортизола и прирост содержания тестостерона. В более поздние сроки (45-60 сутки) отмечается достоверный прирост концентрации тестостерона и кортизола, а также дисбаланс остальных гормонов. Глюкоза крови составила: в норме 4,3+0,8; 1 сутки 35.8+0,12; 3 сутки 26.9+0,35; 21 сутки - 23+0,24; 60 сутки – 22,6+0,22 ммоль/л (p<0,05). При исследовании мочи: удельный вес – 1,03; рH – 6; глюкоза – 17 ммоль/л; белок – 100 мг/дцЛ.

Инсулиновая недостаточность при аллоксановом диабете приводит к усиленному распаду тканевых белков, повышенному поступлению в кровь аминокислот, увеличению общего азота. Характерным нарушением липидного обмена является повышение содержания в сыворотке бета-липопротеидов (ЛПНП) до 41,7 % ( в норме до 19,9 %), триглицеридов до 1,03 ммоль/л (в норме до 0,47 ммоль/л), при р<0,05, а также снижение содержания альфа-холестерина (ЛПВП) с 38,1 % (норма) до 12,8%. Повышение в крови ЛПНП при снижении уровня липопротеидов высокой плотности приводят к развитию атеросклероза, что наблюдалось у животных при гистологическом исследовании крупных сосудов.

При гистологическом исследовании животных с аллоксановым диабетом отмечается прежде всего повреждение островков поджелудочной железы. Резко уменьшается их количество, островки приобретают деформированную форму с явным уменьшением клеточного состава.

Животные в опыт брались через 6 месяцев после введения аллоксана, условно выделяли 3 степени тяжести течения сахарного диабета: легкая – концентрация глюкоза крови была в пределах 10 ммоль/л, средняя - 10-15 ммоль/л, тяжелая – 15 и более. Для трансплантации культур клеток поджелудочной железы использовали 2 группы животных, по 10 в каждой: 1 группа животные с сахарным диабетом средней степени тяжести, 2 группа – тяжелая. Уровень инсулина, глюкозы исследовали через 12 часов и на 1, 5, 10, 30 и 60 сутки после трансплантации. Трансплантацию клеточно-тканевых культур поджелудочной железы крысам производили в переднюю брюшную стенку, толстой иглой в верхний квадрат живота.

Снижение уровня глюкозы отмечали через 2-4 часа после трансплантации, которое сопровождалось повышением уровня инсулина крови до 12,301 мкМЕ\мл и уровня С-пептида до 0,499 нг\мл. В дальнейшем через 3 суток уровень инсулина повышался до 23,117 мкМЕ\мл, а С-пептид – до 0,52 нг\мл, к 60 суткам уровень инсулина был на уровне 2,69+0,2 мкМЕ\мл, а уровень С-пептида 1,32+0,24 нг\мл. Параллельно наблюдалось снижение уровня кортизола с 240,9 до 14,46 нмоль\л, общего трийодтиронина с 1,28 до 0,11 нмоль\л, повышение общего тироксина с 21,09 до 128,85 нмоль\л. В биохимических анализах отмечалось снижение уровня глюкозы до 6,0 ммоль\л в 1 группе и до 7,3 ммоль\л во 2 группе. Так же снижалась концентрация триглицеридов до 0,48 ммоль\л, повышалось содержание ЛПВП до 34,3%, хотя уровень ЛПНП оставался практически неизменен. Данный эффект наблюдался до 3 месяцев, затем постепенно уменьшался и приближался к первоначальным значениям, что свидетельствует об отторжении трансплантата. Регенерация ткани поджелудочной железы осуществляется по всей вероятности за счет паракринного эффекта клеточного трансплантата, который осуществляется в результате выделения биологически активных веществ, направленных на стимуляцию восстановления островков Лангерганса.

Выводы

Аллоксановый диабет сопровождается изменениями в организме животного характерных для сахарного диабета 1 типа человека, в частности гипергликемия сопровождается снижением уровня инсулярных гормонов и повышением концентрации контринсулярных. Помимо прочего отмечается дисбаланс в обмене липопротеидов, что отражается в повышении индекса атерогенности и гистологической картине сосудов характерных для диабетической ангиопатии. В поджелудочной железы отмечается в большом количестве апоптотические тельца в области бывших островков поджелудочной железы. Трансплантация культур клеток поджелудочной железы кролика позволяет в должной мере корригировать уровень гликемии при сахарном диабете у крысы. Трансплантация культуры клеток сопровождается эндокриннокорригирующим эффектом контринсулярных гормонов, что позволяет не только за счет повышения концентрации инсулина и С-пептида уменьшить уровень гликемии, а также стабилизацию биохимических показателей, при гистологическом исследовании отмечалось пролиферация сохранившихся островков поджелудочной железы и преобразование протоковых клеток в эндокринные. Использование культуры клеток поджелудочной железы 3 месячного кролика позволяют наблюдать эффект работы трансплантата в течении 90 суток, а затем наблюдается отторжение трансплантата с его склерозом, что приводит к возвращению показателей крови к первоначальным цифрам. Таким образом, трансплантация культуры клеток поджелудочной железы кролика у крыс с аллоксановым диабетом, позволяет добиться стабилизации гормональных и биохимических показателей, однако данный эффект недолговременный и связан по всей вероятности с склерозом трансплантата и ослабления его эндокриннокорригирующего эффекта, за счет выработки инсулина. Регенерация собственной ткани поджелудочной железы незначительна, что не позволяет в полной мере компенсировать инсулиновый обмен.


Библиографическая ссылка

Михайличенко В.Ю., Столяров С.С. ЭФФЕКТ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 9-4. – С. 670-672;
URL: http://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=7570 (дата обращения: 27.02.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074