Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНТАМИЦИНА И НЕОМИЦИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА

Фарафонова О.В. 1 Ермолаева Т.Н. 1 Еремин С.А. 2
1 ФГБОУ ВПО Липецкий государственный технический университет
2 ФГБОУ ВО Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Предложены методики определения гентамицина и неомицина в пищевых продуктах методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа. Синтезированы трейсеры, рассчитаны константы трейсеров (KT) и аффинности поликлональных антител (KАф), выбраны оптимальные пары иммунореагентов для определения антибиотиков. Рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования (ПР %), значения которых указывают на возможность селективного определения гентамицина и неомицина в присутствии соединений родственной структуры. Градуировочный график линеен в диапазоне 40-5100 нг/мл для гентамицина и 70-2800 нг/мл для неомицина, предел обнаружения гентамицина и неомицина – 9 и 61 нг/мл соответственно. Исследованы экстракционные системы на основе ацетонитрила, гексана, дихлорэтана, ацетона, метанола и фосфатного буферного раствора для выделения неомицина и гентамицина из мяса и яиц. Разработанные методики апробированы для анализа куриного мяса, яиц, молока.
пищевой анализ
гентамицин
неомицин
антибиотики
1. Kaufmamn A. Determination of 11 Aminoglycosides in Meat and liver by liquid chromatography with tandem mass spectrometry / A. Kaufmamn, K. Maden // Journal of AOAC International. – 2005. – V. 88. – P. 1118–1125.
2. Кальницкая О.И. Уровень обнаружения антибиотиков в продуктах убоя, полученных из отечественного и импортного сырья / О.И. Кальницкая, А.Н. Туник, Б.В. Уша // Ветеринария. – 2007. – № 4. – С. 48—53.
3. Jin Y. Development of ELISA and immunochromatographic assay fort he detection on gentamicin / Jin Y., Jang J.K., Han C.H., Lee M. H. J. //Vet Sci. – 2006. – No 7. – P. 111–117.
4. Zhang S. Fluorescence Polarization Immunoassay based on a Monoclonal Antibody for the Detection of Sulfamethazine in chicken muscle / Zhang S., Wang Z., Nesterenko I.S., Eremin S.A., Shen J. //Int. J. Food Sci. Tech. – 2007. – V. 42. – P. 36–44.
5. Tsuruoka M. Rapid Hybridization at High Salt Concentration and Detection of Bacterial DNA Using Fluorescence Polarization / Tsuruoka M., Karube I. //Comb. Chem. High T. SCR. – 2003. – V. 3. -P. 225–234.
6. Goryacheva I.Yu. Rapid all-in-one three-step immunoassay for non-instrumental detection of ochratoxin A in high-coloured herbs and spices/ Goryacheva I.Yu., Saeger S.De, Nesterenko I.S., Eremin S.A., Peteghem C. Van. //Talanta. – 2007. – V.72. – P. 1230–1234.
7. Воронежцева О.В. Определение аминогликозидных антибиотиков в пищевых продуктах методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа / Воронежцева О.В., Еремин С.А., Ермолаева Т.Н. // Вестник ВГУ: серия химия, биология, фармация, Воронеж. – 2009. – № 2 (июль-декабрь). – С. 11–18.
8. Воронежцева О.В. Иммунохимические методы определения аминогликозидных и тетрациклиновых антибиотиков, трициклических антидепрессантов.: Автореф. дис. канд. хим. наук. – Воронеж, 2011. – 18 с.
9. Farafonova O.V. Determination of aminoglycosides in food by fluorescence polarization immunoassay / Farafonova O.V., Vasiliev S.V., Eremin S.A., Ermolaeva T.N. // Международный научно-исследовательский журнал. – 2015. – № 7–2 (38). – Р. 65–69.

Неконтролируемое использование гентамицина и неомицина для лечения и профилактики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота, птицы и пчёл приводит к их накоплению в мышечных тканях животных, молоке, мёде, яйцах. У людей, потребляющих в пищу такие продукты, возможно возникновение аллергических реакций, появление устойчивых к антибиотикам микроорганизмов, что затрудняет проведение лечения. Регламентированная ВОЗ предельно допустимая концентрация гентамицина в мясе крупного рогатого скота и свиней составляет 100 мкг/кг, в молоке 200 мкг/л, неомицина во всех пищевых продуктах 500 мкг/кг [1 – 3]. В продуктах для детского питания неомицин и гентамицин должны отсутствовать.

Наиболее часто для определения аминогликозидных антибиотиков применяют микробиологические и физико-химические методы, имеющие ряд недостатков и ограничений по продолжительности и чувствительности. Метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) позволяет выявлять токсиканты непосредственно в пробе без предварительного выделения и характеризуется относительно высокой чувствительностью, поэтому может быть рекомендован для анализа пищевых продуктов. ПФИА уже положительно зарекомендовал себя для определения антибиотиков в медицинской практике [4 – 6], в тоже время методики определения гентамицина и неомицина в пищевых продуктах до настоящего времени не опубликованы.

Цель настоящего исследования – разработка методик определения гентамицина и неомицина в курином мясе, яйцах и молоке методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.

Материалы и методы исследования

Реактивы: азид, хлорид натрия, сульфат аммония, ацетонитрил, метанол, этанол, хлороформ, ацетон, N-гидроксисукцинимид (о.с.ч., «Sigma-Aldrich», США), триэтиламин, диметилформамид (х.ч. «Merck», Германия); гентамицин (GENT), неомицин (NEO).

Использовали следующие антитела к гентамицину: поликлональные -ПАГ-1 («Abcam», Англия); ПАГ-2 (Китай), ПАГ-3, ПАГ-4, ПАГ-KLH-5 -сконъюгированные с гемоцианином (Королевский колледж, Лондон, Великобритания); моноклональные МАГ (Голландия). Поликлональные антитела к неомицину: ПАН-1 (Китай), ПАН-2 (Королевский колледж, Лондон, Великобритания).

Синтез трейсеров. Для синтеза трейсеров гентамицина в качестве метки использовали – флуоресцеинизотиоционат (ФИТЦ) и 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеин (ДТАФ) («Sigma», США). Трейсер неомицина синтезировали с помощью ФИТЦ. В водно-метанольную смесь для связывания только через одну NH2- группу препарата вводили избыток антибиотика (130 мкмоль). Выделение антибиотиков, меченных флуоресцентной меткой, осуществляли методом тонкослойной хроматографии.

Пробоподготовка мяса и молока. Для извлечения неомицина и гентамицина из куриного мяса и яиц 10 г пробы гомогенизировали, добавляли 100 мл экстрагента и перемешивали в течение 1 ч, (через 20 мин вводили 30 мл 18 %-ого сульфата аммония). Экстракт отделяли фильтрацией и дополнительно очищали от денатурированных белков центрифугированием на настольной центрифуге ЦЛН-2 (КиргизИНТИ, Киргизстан) в течение 8 мин (7000 об/мин). Супернатант использовали для анализа.

Молоко, содержащее менее 2,5 % жира, анализировали после 3-х кратного разбавления боратным буферным раствором. При содержании жира более 2,5 % к 10 мл пробы (молоко, разбавленное в 3 раза) добавляли 5 мл метанола для гидролиза жиров и вводили 2 мл сульфата аммония. Осадок отделяли центрифугированием (3 мин, 7000 об/мин).

Проведение анализа методом ПФИА. К 50 мкл супернатанта добавляли 400 мкл трейсера фиксированной концентрации и 50 мкл антител с концентрацией соответствующей 50 % связыванию. Смесь перемешивали и измеряли поляризацию флуоресценции (двухстадийный формат анализа).

При проведении анализа в одностадийном формате к супернатанту добавляли 450 мкл предварительно синтезированного комплекса антител с трейсером. Для получения комплекса к 500 мл раствора антител с известной концентрацией добавляли 500 мл раствора трейсера. Инкубировали при 25 °С в течение 2 ч и хранили в темном месте при 4 °С.

Результаты исследования и их обсуждение

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ основан на конкуренции определяемого антигена с антигеном, меченным флуоресцентной меткой (трейсер), за ограниченное число центров связывания специфических антител. Аналитическим сигналом в ПФИА служит поляризация флуоресценции, величина которой зависит от концентрации трейсера и антител, строения флуоресцентной метки, присоединяемой к молекуле определяемого соединения, степени очистки трейсера, а также значения констант трейсера (КТ) и аффинности (КАф), указывающих на сродство антител к трейсеру и определяемому соединению [7 – 8].

Выбор концентрации трейсеров осуществляли с учетом величины интенсивности флуоресценции [9]. По максимуму на спектре поглощения при длине волны 492 нм установлены концентрации трейсеров GENT-ФИТЦ; GENT-ДТАФ (250 нг/мл и 40 нг/мл) и NEO-ФИТЦ (180 нг/мл) соответственно. Интенсивность флуоресценции при этом превышает сигнала фона (боратного буферного раствора) в 15 раз.

С помощью графической зависимости mP = f (lg V) с учетом значений mPmax (максимальное значение поляризации флуоресценции для линейного участка графика) и диапазона линейности, определена рабочая концентрация антител (Сантител), соответствующая 50 %-ному связыванию в иммунокомплекс. Использование концентраций антител за пределами линейных зависимостей приводит к искажению сигнала из-за неспецифического связывания трейсера с посторонними компонентами сыворотки. Отмечено, что при применении трейсера с флуоресцентной меткой ДТАФ наблюдается более низкое значение mPmax по сравнению с трейсером на основе ФИТЦ. Несмотря на превышение предельного значения mPmax (100 ед) для всех реагентов, кроме ПАГ-KLH-5 и GENT-ДТАФ (mPmax=89), более низкий предел обнаружения и широкий диапазон определяемых содержаний гентамицина достигаются только при применении антител ПАГ-1, ПАГ-3, ПАГ-4 или антител ПАН-1 при детектировании неомицина (табл. 1).

Для оценки сродства и специфичности определяемых соединений и антител по методике Скэтчарда установлены константы аффинности моноклональных антител. Поскольку поликлональные антитела представляют собой смесь высоко и низко аффинных фракций для них рассчитаны средневесовые значения КАф [6].

Возможность использования иммунореагентов для поляризационного флуоресцентного иммуноанализа оценивали путем сопоставления констант трейсера и констант аффинности (табл. 2).

Установлено, что во всех случаях константа аффинности превышает константу трейсера на 2 порядка (кроме пары ПАГ-1 и GENT-ДТАФ, для которой это отличие незначительно), что указывает на большее сродство антител к определяемым соединениям, чем к соединениям, связанным флуоресцентной меткой и возможность вытеснения трейсера аналитом из комплекса с антителами. Максимальные значения КАФ и различие между КТ и КАф наблюдаются при применении трейсеров GENT-ФИТЦ, NEOM-ФИТЦ и антисывороток ПАГ-3, ПАН-1. Эти пары иммунореагентов были использованы для разработки методик определения гентамицина и неомицина.

Оценку специфичности поликлональных антител осуществляли по значениям коэффициентов перекрестного реагирования (ПР %). Как видно из табл. 3 антитела ПАГ-1 и ПАН-1 показывают 100 % связывание с гентамицином и неомицином и небольшие значения ПР % с другими соединениями родственного строения, которые могут присутствовать в пищевых продуктах. Это в первую очередь стрептомицин, входящий в состав комбинированных ветеринарных препаратов наряду с гентамицином (ПР % менее 0,1) и бацитрацин, применяемый как кормовой антибиотик, следовательно, при применении этих антител возможно селективное определение гентамицина и неомицина методом ПФИА.

Изучены условия определения антибиотиков с использованием антител предварительно связанных с трейсером в иммунокомплекс. Сопоставлены метрологические характеристики определения неомицина и гентамицина методом ПФИА с применением комплексов антител с трейсером (одностадийный формат анализа) и свободных (двухстадийный формат анализа) антител (табл. 4). Отмечено, что применение комплексов антител с трейсером не приводит к изменению диапазона определяемых содержаний и снижению предела обнаружения. В тоже время повышается стабильность раствора антител, так при повторном анализе не наблюдается отклонения от градуировочного графика (срок хранения возрастает с 7 до 50 дней), однако продолжительность получения аналитического сигнала увеличивается с 7 до 20 мин).

Для выделения неомицина и гентамицина из куриного мяса и яиц применяли экстракционные системы на основе ацетонитрила, гексана, дихлорэтана, ацетона, метанола и фосфатного буферного раствора (pH 7,2). Сопоставление значений R % антибиотиков показало, что только фосфатный буферный раствор, содержащий сульфат аммония, и ацетонитрил обеспечивают практически полное извлечения лекарственных препаратов из мяса и яиц (R 96 %). Применение в качестве экстрагентов гексана, ацетона, дихлорэтана менее эффективно.

Разработанные методики апробированы при анализе куриного мяса, яиц и молока (табл. 5).

Таблица 1

Выбор рабочей концентрации антител для определения гентамицина и неомицина

Антитела

Трейсер

mPmax

Диапазон линейности (lg V)

Сантител, мг/мл

ПАГ-1

ДТАФ

215

2-4

0,20

ФИТЦ

245

2-5

0,17

ПАГ-3

ДТАФ

189

3-5

0, 18

ФИТЦ

202

3-5

0, 15

ПАГ-4

ДТАФ

148

2-4

0,35

ФИТЦ

165

2-5

0,27

ПАГ-KLH-5

ДТАФ

89

2-3

0,09

ФИТЦ

112

2-3

0,08

ПАГ-2

ФИТЦ

152

2-4

0,41

МАГ

ФИТЦ

178

2-3

0,26

ПАН-1

ФИТЦ

164

2-4

0,15

ПАН-2

ФИТЦ

153

2-3

0,28

Таблица 2

Константы аффинности и константы трейсера

Пара иммунореагентов

КАФ·10 -8

КТ·10 -6

GENT-ФИТЦ + ПАГ-1

3,6

4,1

GENT-ДТАФ+ ПАГ-1

0,2

9,8

GENT-ФИТЦ + ПАГ-3

18,2

6,4

GENT-ДТАФ+ПАГ-3

5,6

0,2

GENT-ФИТЦ + ПАГ-4

4,5

4,7

GENT-ФИТЦ + ПАГ-2

5,6

1,2

GENT-ФИТЦ + МАГ

2,3

0,7

NEOM-ФИТЦ +ПАН-1

32,5

1,9

Таблица 3

Коэффициенты перекрестного реагирования (ПР %) поликлональных антител

Структурные аналоги

ПР % для гентамицина

ПР % для неомицина

Гентамицин

100,0

1,0

Канамицин

< 0,1

3,2

Стрептомицин

< 0,1

1,2

Дигидрострептомицин

< 0,1

1,0

Амикацин

5,0

0,8

Неомицин

< 0,1

100,0

Тобрамицин

3,0

4,3

Бацитрацин

2,5

5,7

Таблица 4

Метрологические характеристики определения гентамицина и неомицина методом ПФИА

Иммунореагенты

Двухстадийный

Одностадийный

Сmin,нг/мл

Диапазон определяемых содержаний, нг/мл

Сmin,нг/мл

Диапазон определяемых содержаний, нг/мл

GENT-ФИТЦ + ПАГ-1

11

50–4500

9

40–5100

NEOM-ФИТЦ +ПАН-1

50

70–2500

61

70–2800

Таблица 5

Результаты определения гентамицина и неомицина в экстракте из пищевых продуктов (P = 0,95, n = 3)

Объекты исследования

Найдено гентамицина, нг/мл

Найдено неомицина, нг/мл

Грудки куриные

Канада

78 ± 1

55 ± 4

Москва, Россия

105 ± 1

0,15 ± 0,1

Липецк, Россия

57 ± 2

60 ± 6

Яйца «Золотой петушок»

Липецк, Россия

62 ± 3

не обнаружено

Методики характеризуются высокой воспроизводимостью и селективностью. Не выявлено превышения регламентируемого содержания неомицина в курином мясе, яйцах и молоке, концентрация гентамицина в мясе превышает нормативы, установленные для стран ЕС (100 мкг/кг).

Заключение

Предложены методики определения гентамицина и неомицина на уровне ПДК и ниже в пищевых продуктах методом ПФИА. Градуировочный график линеен в диапазоне 40-5100 нг/мл для гентамицина и 70-2800 нг/мл для неомицина, предел обнаружения гентамицина и неомицина 9 и 61 нг/мл соответственно. Методики апробированы при определении антибиотиков в курином мясе, яйцах и молоке.


Библиографическая ссылка

Фарафонова О.В., Ермолаева Т.Н., Еремин С.А. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНТАМИЦИНА И НЕОМИЦИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 11-1. – С. 28-31;
URL: http://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=7666 (дата обращения: 07.03.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074