Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ 16S МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ И АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ГРУНТОВ БАТАГАЙСКОГО ПРОВАЛА

Журлов О.С. 1 Грудинин Д.А. 2 Яковлев И.Г. 2
1 Центр коллективного пользования научным оборудованием Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН
2 Институт степи УрО РАН
Проведено исследование структуры микробиома грунтов Батагайского провала с использованием молекулярно-генетических и культуральных методов исследования. Нами показано, что основу микробиома грунтов Батагайского провала составляют три фила Proteobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes. Из проб грунта выделены психротолерантные, аэротолерантные кокки, обладающие β-гемолитической активностью и резистентные к антибактериальным препаратам (линкомицин, сульфотиазол, полимиксин В, ванкомицин, хлорамфеникол, цефуроксим).
 Батагайский провал
психротолерантные бактерии
устойчивость к антибактериальным препаратам
1. Андронов Е.Е., Пинаев А.Г., Першина Е.В., Чижевская Е.П. Выделение ДНК из образцов почвы (методические указания). – СПб: ВНИИСХМ РАСХН, 2011. – 27 с.
2. Журлов О.С., Гриценко В.А., Брудастов Ю.А. Влияние температуры культивирования на физиологические и физико-химические свойства Escherichia coli K12 // Вестник ОГУ. – 2009. – №12. – С.106-110.
3. Куницкий В.В., Сыромятников Л. и др. Льдистые породы и термоденудация в районе поселка Батагай (Янское плоскогорье, Восточная Сибирь) // Криосфера Земли. – 2013. – № 1. – С.56–68.
4. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Seventeenth informational supplement. CLSI Document M100-S17. January. – 2007.
5. Dziewit L., Bartosik D. Plasmids of psychrophilic and psychrotolerant bacteria and their role in adaptation to cold environments // Front Microbiol. – 2014. – Vol.5. – Art. 596.
6. Gilichinsky D., Rivkina E., Shcherbakova V. et al. Supercooled water brines within permafrost–an unknown ecological niche for microorganisms: a model for Astrobiology // Astrobiology. – 2003. – Vol. 3. – P.331-341.
7. Kondakova A.N., Novototskaya-Vlasova K.A., Drutskaya M.S. et al. Structure of the O-polysaccharide chain of the lipopolysaccharide of Psychrobacter muricolla 2pST isolated from overcooled water brines within permafrost // Carbohydrate research. – 2012. – Vol. 349. – P.78-81.
8. Krivushin K.V., Shcherbakova V.A., Petrovskaya L.E. et al. Methanobacterium veterum sp. nov., from ancient Siberian permafrost // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2010. – Vol.60. – P.455-459.
9. Mardanov A.V., Bulygina E.S., Nedoluzhko A.V. et all. Molecular analisis of the intestinal microbiome composition of mammoth and woolly rhinoceros // Doklady biochemistry and biophysics. – 2012. – Vol.445. – P.203-206.

Изменение климата на севере Янского плоскогорья приводит к термоденудации криолитозоны (таянию ископаемого льда, образованию термоэрозий, термокастровых образований), что способствует формированию разрезов криолитозоны Янского плоскогорья [3].

Одним из примеров влияния на криолитозону процессов терморазрушения является Батагайский провал, расположенный в северо-восточной части республики Саха (Якутия), в 10 км к юго-востоку от пос. Батагай (67º34’ с.ш.; 134°46’ в.д.) Верхоянского района в пределах природной подзоны северотаежных лиственничных лесов.

Образование Батагайского провала привело к уникальному явлению, появлению прогретых стен лёсса, с обнажением более глубоких слоев вечной мерзлоты (высота обнажения Батагайского провала около 60 метров). Дно провала осложнено гребневидными грядами-останцами, сложенными из переотложенных в результате термоэрозии лессовидных пород. Формирующиеся на грядах, лишенных мерзлоты, травянистые сообщества, резко отличаются от произрастающей растительности ландшафтов подзоны северотаежных лиственничных лесов, в пределах которой находится Батагайский провал.

В августе-сентябре 2014 года была организована научная экспедиция сотрудников Института степи УрО РАН в район Батагайского провала, с отбором проб воды и грунтов лёсса, для проведения химического и микробиологического анализа.

Использование методов молекулярно-генетического анализа, в сочетание с методами культивирования бактерий на искусственных питательных средах, позволяет достаточно полно охарактеризовать биологическое разнообразие микроорганизмов, содержащихся в слоях вечной мерзлоты [6, 7, 8] и в палеообразцах ископаемых животных [9].

В связи с этим, целью исследования явилось определение качественного состава почвенного микробиома грунтов Батагайского провала, выделение культур психротолерантных, аэротолерантных бактерий и исследование их морфо-физиологических свойств и устойчивости к антибактериальным препаратам.

Материалы и методы исследования

Штаммы и условия культивирования. Образцы воды, в количестве 100 мкл, с пленкой вытаявшей органики и без органики заливали 2 мл жидкой питательной среды и оставляли для роста в рефрижераторе при +4ºС, при периодическом шутелировании. Пробы воды из ручья Батагайского провала, в объеме 300 мл, и 48 часовые культуры, в объеме 100 мл, фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм (“Millipore”, США). Фильтры оставляли в рефрижераторе при -20ºС, до проведения 16S метагеномного анализа.

Для культивирования бактерий использовали жидкую и плотную питательные среды (НПО «Питательные среды», г. Махачкала).

Высевы, на твердую питательную среду, из жидкой питательной среды делали сразу, и на первые, на вторые, и на девятые сутки. Морфологические, тинкториальные и физиологические свойства бактерий оценивали с помощью микроскопических и бактериологических методов исследования. Морфологию колоний бактерий оценивали по форме, размеру и пигментообразованию.

Определение антибиотикорезистентности. Резистентность к антибактериальным препаратам, для всех включенных в исследование чистых культур бактерий, была определена в соответствие с рекомендациями (NCCLS) [4]. Бактериальный инокулят был получен путем суспендирования бактерий в стерильном 0,15 М NaCl, который доводили до 0,5 OD по стандарту McFarland. Устойчивость к антибиотикам тестировали c помощью диско-диффузионной пробы на агаре Мюллера-Хинтон в следующих концентрациях: гентамицин 10 мкг, хлорамфеникол 30 мкг, ванкомицин 30 мкг, канамицин 30 мкг, цефуроксим 30 мкг, полимиксин B 300 ед., неомицин 30 мкг, линкомицин 15 мкг, сульфатиазол 10 мкг. Диаметр зон и приравненных к ним минимальные ингибирующие концентрации (МИК), оценивались в соответствие со стандартами определения антибиотикорезистентности [4].

Филогенетический 16S метагеномный анализ. Геномную ДНК выделяли по оригинальной методике [1]. Секвенирование (NGS) проводили на секвенаторе MiSeq System (Illumina, США). Анализ и обработку данных осуществляли в программе USEARCH v8.0.1623 _win32.

Результаты исследования и их осбуждение

В результате проведенного 16S метагеномного анализа проб грунта Батагайского провала, было показано, что основу микробиома составляют три мажорных фила – Proteobacteria – 65.96 %, Bacteroidetes – 9.25 % и Firmicutes – 6.08 % и четыре минорных – Verrucomicrobia – 2.77 %, Nitrospirae-1.72 %, Planctomycetes – 1.52 %, Chlamydiae-1.68 % всех ридов. Метагеномный анализ воды, из ручья Батагайского провала, дополнительно выявил еще два фила (Actinobacteria – 3.1 % и Tenericutes – 3.11 %).

Семейства бактерий, входящих в микробиом грунтов Батагайского провала, были представлено такими таксонами, как – Rhodocyclaceae – 17.12 %, Rhodospirillaceae – 7.2 %, Hyphomicrobiaceae – 4.91 %, Legionellaceae – 4.14 %, Sphingobacteriaceae – 2.64 %, Chitinophagaceae – 2.51 %, Thermoanaerobacteraceae – 2.35 % всех ридов. Качественный состав семейств бактерий, полученный в результате 16S метагеномного анализа воды, несмотря на схожесть представительства некоторых семейств, отличался (Rhabdochlamydiaceae-12.75 %, Hyphomicrobiaceae – 5.93 %, Comamonadaceae – 5.93 %, Bacillaceae – 4.74 %, Phyllobacteriaceae – 2.94 %, Legionellaceae – 2.72 %, Rhodocyclaceae – 2.66 % ридов).

С помощью метагеномного анализа удалось идентифицировать микроорганизмы, входящие в состав грунтов Батагайского провала (Legionella rowbothamii – 2.53 %, Thermoanaerobacter inferii – 1.81 %, Rhodothermus clarus – 1.63 %, Candidatus Rhabdochlamydia crassificans – 1.44 %, Desulfonatronum thiosulfatophilum – 1.38 %, Pedobacter koreensis – 1.20 %, Oleomonas sagaranensis – 1.17 % всех ридов) и воды (Candidatus Rhabdochlamydia – 12.51 %, Legionella rowbothamii – 2.71 %, Phyllobacterium catacumbae – 2.66 %, Desulfonatronum thiosulfatophilum – 2.21 %, Arthrospira fusiformis – 1.09 % всех ридов).

На следующем этапе исследования, используя методику накопительных культур, через 48 часов культивирования (+4ºС) из образца грунта лёсса нами были выделены бактерии, формирующие при росте на твердой питательной среде, 4 типа колоний: темно-оранжевые; белые-матовые; бледно-белого и желтого цвета. Общее содержание бактерий (КОЕ) выделенных из 1 грамма грунта лёсса (разных образцов) составило от 2×102 до 3,5×103 КОЕ.

Всем психротолерантным (выросшим при температуре +4ºС) бактериям, была дана характеристика их морфо-физиологических свойств, гемолитической активности и устойчивости к антибактериальным препаратам (таблица).

Из образцов воды не удалось выделить бактерии, при используемой методике выделения, ни через 24 часа, 48 часов и 9 дней культивирования.

Обсуждение. Результаты исследования свидетельствуют о том, что бактериальное сообщество грунтов Батагайского провала гетерогенно по составу. Наряду с доминирующими филами (Proteobacteria – 65.96 %, Bacteroidetes – 9.25 % и Firmicutes – 6.08 %), характерными для засоленных почв, в состав микробиома входят несколько минорных фил.

Особенностью микробного сообщества грунтов является, то, что три семейства (Legionellaceae, Rhodocyclaceae, Hyphomicrobiaceae) встречаются в пробах грунтов и воды, как и три идентифицированных вида бактерий (Legionella rowbothamii, Desulfonatronum thiosulfatophilum, Candidatus Rhabdochlamydia crassificans), что свидетельствует о доминировании этих таксонов в составе микробиома грунтов Батагайского провала.

Выделение кокковой флоры, обладающей гемолитической активностью и резистентностью к антибактериальным препаратам, свидетельствует о возможной антропогенной контаминации воды и грунта или принесенных ветром частицами грунта бактерий, представителей почвенного микробиома северотаежных лиственничных лесов.

Однако, проявляемая некоторыми выделенными культурами бактерий гемолитическая активность (при +35°С), способность расти в широком диапазоне температур (от +4°С до +35°С), свидетельствует о высоком адаптивном потенциале психротолератных бактерий и экологической пластичности их геномов, что может способствовать экспрессии факторов патогенности [5]. Ранее нами было показано, что адаптация к суб- и супраоптимальной температуре культивирования приводит к изменению морфо-физиологических и физико-химических свойств бактерий [2].

Применяя молекулярно-генетические и культуральные методы исследования мы лишь приподняли завесу качественного состава бактерий, контаминирующих оттаивающую органику и грунты Батагайского провала.

Морфо-физиологические свойства и антибиотикорезистентность аэротолерантных, психротолерантных бактерий, выделенных из грунта лёсса Батагайского провала

Характеристики штамма

Штамм S4T4c1

Штамм S4T4c2

Штамм S5T22c2-48

Штамм S5T22c3-48

Окраска по Граму

Грамположительные кокки (окраска вариабельна), одиночно расположены

Грамположительные кокки, одиночно расположены

Грамотрицательные кокки, одиночно расположены

Грамотрицательные кокки, одиночно расположены

Температура роста

+4ºС до +35ºС, оптимальная температура культивирования – 22ºС

+4ºС до +35ºС

+4ºС до +35ºС

+4ºС до +35ºС

Рост на средах

Растут на средах содержащих 10 % NaCl. При росте на желточно-солевом агаре проявляют лецитовитилазную активность. Не растут на среде Эндо

Растут на простых средах. Не растут на средах содержащих 10 % NaCl. Не растут на среде Эндо

Растут на простых средах и средах содержащих 10 % NaCl. Не растут на среде Эндо

Растут на простых средах. Не растут на средах содержащих 10 % NaCl. Не растут на среде Эндо

Характеристика колоний

Крупные колонии с неровными краями, темно-оранжевого цвета, растут над поверхностью агара, диаметр 3-4 мм

Крупные колонии, округлые, края ровные, бледно-белого цвета, ростут над поверхностью агара, диаметр 3-4 мм

Мелкие колонии с неровными краями, желтого цвета, растут над поверхностью агара, в диаметре 1-2 мм

Мелкие колонии с неровными краями, белого цвета, растут над поверхностью агара, диаметр 1-2 мм

Гемолитическая активность

При росте на кровяном агаре (+35ºС; 18 часов) образуют зону β-гемолиза (d=21 мм)

Не обладает гемолитической активностью

Обладают гемолитической активностью (β-гемолиз, d=8 мм), при температуре +35ºС

Не обладают гемолитической активностью

Резистентность к антибактериальным препаратам

Полимиксин В, линкомицин

Линкомицин, ванкомицин, сульфотиазол, хлорамфеникол, цефуроксим

Линкомицин, сульфотиазол

Линкомицин, сульфотиазол

Чувствительность к антибактериальным препаратам

Гентамицин, левомицетин, ванкомицин, канамицин, цефуроксим, неомицин, сульфотиазол, хлорамфеникол

Гентамицин, левомицетин, канамицин, неомицин, полимиксину В

Гентамицин, левомицетин, канамицин, ванкомицин, неомицин, полимиксин В, цефуроксим, хлорамфеникол

Гентамицин, левомицетин, канамицин, ванкомицин, неомицин, полимиксин В, цефуроксим, хлорамфеникол


Библиографическая ссылка

Журлов О.С., Грудинин Д.А., Яковлев И.Г. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ 16S МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ И АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ГРУНТОВ БАТАГАЙСКОГО ПРОВАЛА // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 11-5. – С. 648-651;
URL: http://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=7854 (дата обращения: 25.02.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074