Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ВЛИЯНИЕ ТРАНСАМИНАЗ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ PSEUDOMONAS AERUGINOSA, НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ КЛЕТОК МОРСКОЙ СВИНКИ И МЫШИ IN VITRO

Тарасенко Т.Н. 1 Габалов К.П. 1 Рюмина М.В. 1 Староверов С.А. 1, 2 Волков А.А. 1, 2
1 ФГБНУ «Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт»
2 ФГБОУ ВО Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова
Вирулентные и авирулентные клинические изоляты Pseudomonas aeruginosa при росте на искусственной среде способны выделять ферментативные активности аланинаминотрансферазу (АЛТ) и аспартатаминотрансферазу (АСТ). Данные ферменты, наряду с их липополисахаридом, стимулируют дыхательную активность перитонеальных клеток (ПК) мыши и морской свинки in vitro. Стимулирующее влияние АЛТ и АСТ опосредовано потребностью ПК в их продуктах – пирувате и α-кетоглутарате. В ходе выполнения данной научно-исследовательской работы была обнаружена способность культур вирулентных и авирулентных изолятов P. aeruginosa выделять в среду ферментативные активности АСТ и АЛТ, кроме того было выполнено определение характера влияния указанных ферментов на дыхание перитонеальных клеток мыши и морской свинки в присутствии ЛПС указанных изолятов псевдомонад.
Pseudomonas aeruginosa
АЛТ
АСТ
перитонеальныеклетки
липополисахариды
1. Влияние липополисахаридов различных изоляторов Pseudomonas aeruginosa на печень и перитонеальные клетки белых крыс / К.П. Габалов [и др.] // Известия Саратовского университета. Новая серия. Сер.: Химия. Биология. Экология. – 2011. – Вып. 2. С. 98–100.
2. Влияние трансаминаз на изменения интенсивности дыхания перитонеальных клеток морской свинки в ответ на БЦЖ in vitro / К.П. Габалов, М.Л. Малинин, Т.Н. Тарасенко [и др.] // Ветеринарная медицина домашних животных: Сборник статей. – Выпуск 7. – Казань: Печатный двор, 2010. – 308 с. – С. 94–97.
3. Камышников В.С. Справочник по клинико–биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т. 1 / В.С. Камышников // Мн.: Беларусь. – 2000. – 495 с.
4. Лакин Г.Ф. Основы биометрии / Г.Ф. Лакин. – М.: Высшая школа – 1990. – C. 251–255.
5. Park B.H. Indefication and nitroblue tetrasolium reduction by neutrophils: 3 diagnostic act/ B.H. Park, S.M. Fikring // Lancet. –1968.– V. 11. – P. 532 – 534.
6. Wiegel J. Isolation of Lipopolysacсharides and the Effect of Polymyxin B on the Outer Membrane of Corynebacterium autotrophicum / J. Wiegel, F. Mayer// Archives of Microbiology. – 1978. – v. 118. – p. 67–69.
7. Guliy O.I., Bunin V.D., Ignatov O.V., et al. Effect of sulphanilamides on the electrophysical properties of microbial cells // Anti-Infective Agents. – 2014. – Т. 12. № 2. – С. 191–197.
8. Staroverov S.A., Fomin A.S., MezhennyyP.V. , et al. The usage of phage mini-antibodies as a means of detecting ferritin concentration in animal blood serum // Journal of Immunoassay and Immunochemistry. – 2015. – V. 36. № 1. – P. 100–110.

Pseudomonas aeruginosa обладает различными факторами вирулентности, одним из которых является липополисахарид (ЛПС). Он накапливается в организме при лизисе бактериальных клеток и вызывает разнообразные поражения организма. При этом в окружающую среду выделяются и разнообразные ферменты, в частности, ферменты энергетического обмена. Ранее для крыс было показано in vitro выделение гепатоцитами АСТ и АЛТ в ответ на ЛПС изолятов P. aeruginosa и влияние этих ферментов на дыхание активированных данными ЛПС перитонеальных клеток (ПК), при этом дыхание зависит от активности АЛТ и АСТ [1]. Также было показано, что дыхание перитонеальных клеток морской свинки при фагоцитозе клеток Mycobacterium bovis стимулируется АЛТ и АСТ in vitro [2].

Целью данной работы было обнаружение способности культур вирулентных и авирулентных изолятов P. aeruginosa выделять в среду ферментативные активности АСТ и АЛТ, и определение характера влияния указанных ферментов на дыхание перитонеальных клеток мыши и морской свинки в присутствии ЛПС указанных изолятов псевдомонад.

Материалы и методы исследования

В работе использовались изоляты P. aeruginosa 4, 8 (вирулентные), 11, 12, (авирулентные). Из суточных культур изолятов на жидкой среде № 8 (Оболенск) получали очищенные центрифугированием (20000g, 40 мин) культуральные жидкости (КЖ) и клетки бактерии. В полученных супернатантах определяли концентрацию белка, активность АСТ, АЛТ и рассчитывали отношение АСТ/АЛТ (коэффициент Де Ритиса) [3]. Из клеток изолятов получали ЛПС по Вестфалю [6].

Определяли дыхание перитонеальных клеток (ПК) в тесте восстановления нитросинего тетразолия (тест НСТ) [5, 7, 8] при ответе на ЛПС P. aeruginosa 8 в зависимости от концентрации пирувата и α-кетоглутарата. ПК мыши и морской свинки (от 10 животных каждого вида) суспендировали в среде ДМЕМ до концентраций 1 млн клеток/мл; в суспензии вносили нитросиний тетразолий (НСТ) до конечной концентрации 0,01 %. Суспензии ПК делили на ряд аликвот, в аликвоты, кроме контрольной, вносили ЛПС P. aeruginosa 8 до конечной концентрации 4 мкг/мл. В аликвоты суспензий ПК добавляли пируват в концентрациях 54 – 120 мкМ/л, α-кетоглутарат – от 23 до 51 мкМ/л и их сочетания. Суспензии ПК инкубировали 1 час при 37 °С, определяли накопление формазана спектрофотометрически.

Влияние культуральных жидкостей изолятов P. aeruginosa на дыхание ПК определяли аналогично описанному выше. ПК мыши и морской свинки суспендировали в среде 199, добавляли 1/10 объема КЖ, получая суспензии 1 млн клеток/мл, вносили ЛПС соответствующего изолята до 4 мкг/мл и определяли накопление формазана в тесте НСТ.

Определяли коэффициенты корреляции Пирсона и множественной корреляции между дыханием ПК в тесте НСТ и концентрациями пирувата и α-кетоглутарата, а также активностями АЛТ, АСТ и значениями коэффициента Де Ритиса [4].

Результаты исследования и их обсуждение

Накопление формазана в тесте НСТ ПК мыши и морской свинки, стимулированных ЛПС P. aeruginosa 8, в присутствии пирувата и α-кетоглутарата представлено на рисунке. ЛПС стимулирует дыхание, дыхание контрольных ПК мыши составляет 27 ± 6 нг/млн. клеток, контрольных ПК морской свинки – 34 ± 5 нг/млн. клеток. А-кетоглутарат и пируват стимулируют дыхание ПК, причем первый заметно сильнее при 37 мкМ, второй – при 94 мкМ. При этом максимум дыхания ПК как мыши, так и морской свинки достигается при сочетании пируват/αp>

Корреляционный анализ более отчетливо выявляет связь дыхания с пируватом и α-кетоглутаратом (табл. 1).

tar1a.wmf tar1b.wmf

А Б

Дыхание перитонеальных клеток мышей (А) и морских свинок (Б), стимулированных ЛПС P. aeruginosa 8, в присутствии пирувата и α-кетоглутарата (α-КГ)

Таблица 1

Значения коэффициентов корреляции Пирсона (r) и множественной корреляции (R) дыхания перитонеальных клеток мыши и морской свинки с пируватом и α-кетоглутаратом в присутствии ЛПС P. Aeruginosa 8

 

НСТ ПК мыши

НСТ ПК морской свинки

Пируват, r

С чистым пируватом

+ 0,83

+ 0.46

В присутствии α-кетоглутарата

+ 0,96

+ 0.89

α-кетоглутарат, r

С чистым α-кетоглутаратом

+ 0,86

+ 0.43

В присутствии пирувата

+ 0,93

+ 0.87

Корреляция с парой пируват/α-кетоглутарат, R

0,96

0.90

Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные значения коэффициентов корреляции (p < 0.05).

Дыхание ПК мыши связано с обеими кетокислотами вместе и с каждой из них в отдельности, однако и дыхание ПК морской свинки в присутствии обеих кетокислот связано с каждой из них. Об этом же свидетельствуют высокие достоверные коэффициенты множественной корреляции дыхания ПК с парой пируват/α-кетоглутарат, т.е. обе кетокислоты стимулируют дыхание ПК обоих видов животных. Результат вполне объясним тем, что эти кетокислоты утилизируются в цикле Кребса, рост их концентрации в среде позволяет усилить дыхательный метаболизм ПК при ответе на антиген.

Изоляты P. aeruginosa выделяют в культуральную жидкость заметное количество белка и активности АСТ и АЛТ (табл. 2). Выделение ферментативных активностей соотносится с выделением белка и не имеет выраженной связи с вирулентностью изолята.

Таблица 2

Биохимические параметры культуральных жидкостей изолятов P. aeruginosa

 

изолят

Белок, г/л

АСТ, нкат/л

АЛТ, нкат/л

Коэффициент Де Ритиса

вирулентные

4

0,49 ± 0,1

0,47 ± 0,1

0,20 ± 0,1

2,31 ± 0,3

8

1,82 ± 0,3

3,92 ± 0,5

1,00 ± 0,2

3,91 ± 0,5

авирулентные

11

0,99 ± 0,2

2,60 ± 0,4

0,45 ± 0,1

5,67 ± 0,6

12

1,53 ± 0,2

0,73 ± 0,2

0,33 ± 0,1

2,26 ± 0,3

Культуральные жидкости в сочетании с ЛПС изолятов P. aeruginosa оказывают стимулирующее влияние на дыхание ПК, причем это влияние мало зависит от вирулентности изолята (табл. 3).

Таблица 3

Накопление формазана перитонеальными клетками (ПК) морской свинки и мыши в присутствии культуральных жидкостей (КЖ) и липополисахарида (ЛПС) изолятов P. aeruginosa, нг формазана на млн. ПК

 

Вирулентные изоляты

Авирулентные изоляты

Среда ДМЕМ

 

КЖ + ЛПС изолята 4

КЖ + ЛПС

изолята 8

КЖ + ЛПС изолята 11

КЖ + ЛПС

изолята 12

ПК морской свинки

14,1 ± 1,6

19,7 ± 6,1

20,6 ± 4,7

17,9 ± 2,6

11,9 ± 1,5

ПК мыши

8,4 ± 0,6

8,9 ± 0,7

8,7 ± 0,9

8,4 ± 0,7

7,8 ± 0,5

Примечание: жирным шрифтом выделены значения, достоверно отличающиеся от контроля (p < 0.05).

Дыхание перитонеальных клеток положительно связано с активностями АЛТ и АСТ, а также с коэффициентом Де Ритиса, о чем свидетельствуют значения коэффициентов корреляции Пирсона между дыханием ПК и указанными биохимическими параметрами КЖ (табл. 4).

Таблица 4

Значения коэффициентов корреляции Пирсона дыхания перитонеальных клеток (ПК) мыши и морской свинки с активностью АЛТ, АСТ и коэффициентом Де Ритиса в присутствии ЛПС P. aeruginosa

 

ПК мыши

ПК морской свинки

Корреляция с АЛТ

+ 0,69

+ 0,67

Корреляция с АСТ

+ 0,65

+ 0,70

Корреляция с коэффициентом Де Ритиса

+ 0,60

+ 0,42

Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные значения коэффициентов корреляции (p < 0.05).

В среде ДМЕМ отсутствовали специфические факторы регуляции активности перитонеальных клеток со стороны макроорганизма (комплемент, интерлейкины и т.д.), это означает, что действие трансаминаз на дыхание связано именно с катализируемыми трансаминазами биохимическими реакциями.

АЛТ катализирует обратимое превращение L-аланина и α-кетоглутарата в пируват и L-глутматат, АСТ стимулирует обратимое превращение L-аспартата и α-кетоглутарата в оксалоацетат и L-глутматат. Сопряженные реакции, катализируемые АЛТ и АСТ, способны поддерживать равновесную концентрацию кетокислот, причем повышенная активность АЛТ ведет к накоплению в среде пирувата, АСТ – к накоплению α-кетоглутарата, т.е. кетокислот, стимулирующих дыхание перитонеальных клеток (табл. 1). Таким образом, положительная связь дыхания перитонеальных клеток с активностью трансаминаз АЛТ и АСТ может объясняться поддержанием оптимальных для дыхательного метаболизма ПК концентраций кетокислот, в частности – пирувата и α-кетоглутарата.

Заключение

Pseudomonas aeruginosa способен стимулировать ответ перитонеальных клеток не только за счет своего эндотоксина – ЛПС, но также выделяемых из клеток бактерии трансаминаз АЛТ и АСТ. В действии АЛТ и АСТ на дыхание перитонеальных клеток проявляется стимулирующее влияние непосредственно на метаболический статус через концентрацию субстратов цикла Кребса – пирувата и α-кетоглутарата.


Библиографическая ссылка

Тарасенко Т.Н., Габалов К.П., Рюмина М.В., Староверов С.А., Волков А.А. ВЛИЯНИЕ ТРАНСАМИНАЗ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ PSEUDOMONAS AERUGINOSA, НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ КЛЕТОК МОРСКОЙ СВИНКИ И МЫШИ IN VITRO // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 8-5. – С. 760-763;
URL: https://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=10164 (дата обращения: 26.01.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074