Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ГИППОКАМПА НА РАННЕМ СРОКЕ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО СТРЕССОВОГО РАССТРОЙСТВА У КРЫС

Сидорова М.В. 1 Ваколюк И.А. 1
1 Институт живых систем (ИЖС)
Цель исследования состояла в моделировании посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) у нелинейных крыс дикого типа и выяснении возможных структурных изменений в области гиппокампа на раннем сроке после формирования состояния тревожного расстройства. Для формирования у крыс симптомов, аналогичных при ПТСР, применяли модель «стресс-рестресс» с внесением модификации (дополнительный триггер в рестрессе). Результаты поведенческого фенотипирования показали, что наиболее значительным был критерий «время пребывания» для открытых и закрытых рукавов лабиринта, а также в центральной области. Морфометрическое измерение объемов как правого, так и левого гиппокампа показало отсутствие статистически значимых различий между контрольной и экспериментальной группами. Полученные результаты предполагают, что данная модель ПТСР требует большего времени для формирования видимых структурных изменений в мозге.
посттравматическое стрессовое расстройство
модель «стресс-рестресс»
поведенческое фенотипирование
гиппокамп
1. Баранова К.А. Экспрессия транскрипционных факторов в мозге крыс при формировании тревожно-депрессивных состояний и реализации антидепрессивных эффектов гипоксического прекондиционирования: дис. ... кандидата биологических наук: 03.03.01 / Баранова Ксения Александровна. – Санкт-Петербург, 2013. – 23 с.
2. Безнин Г.В. Структурно-функциональные основы нарушений поведения на модели посттравматического стрессового расстройства у крыс: дис ... кандидата медицинских наук: 03.03.01, 03.03.04 / Безнин Глеб Владимирович. – Санкт-Петербург, 2014. – 164 с.
3. Ebenezer P.J., Wilson C.B., Wilson L.D. et al. The anti-inflammatory effects of blueberries in an animal model of post-traumatic stress disorder (PTSD) // PLoS ONE, 2016, vol. 11(9). – P. 1–17.
4. Karl A., Schaefer M., Malta L.S. et al. A meta-analysis of structural brain abnormalities in PTSD // Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 2006, vol. 30 (7). – P. 1004–1031.
5. Pitman R.K., Rasmusson A.M., Koenen K.C. et al. Biological Studies of Posttraumatic Stress Disorder // Nature Reviews Neuroscience, 2012, vol. 13(11). – P. 769–787.
6. Schmidt U., Kaltwasser S.F., Wotjak C.T. Biomarkers in Posttraumatic Stress Disorder: Overview and Implications for Future Research // Disease Markers, 2013, vol. 35 (1). – P. 43–54.
7. Whitaker A.M., Gilpin N.W., Edwards S. Animal models of post-traumatic stress disorder and recent neurobiological insights // Behavioural pharmacology, 2014, vol. 25. – P. 398–409.
8. Woon F.L., Sood S., Hedges D.W. Hippocampal volume deficits associated with exposure to psychological trauma and posttraumatic stress disorder in adults: a meta-analysis // Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 2010, vol. 34 (7). – P. 1181–1188.
9. Yamamoto S., Morinobu S., Takei S et al. Single prolonged stress: toward an animal model of posttraumatic stress disorder // Depression and Anxiety, 2009, vol. 26. – P. 1110–1117.
10. Zoladz P.R., Park C.R., Fleshner M. et al. Psychosocial predator-based animal model of PTSD produces physiological and behavioral sequelae and a traumatic memory four months following stress onset // Physiology and Behavior, 2015, vol. 147. – P. 183–192.

Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) является единственным серьезным психическим расстройством, имеющим определенное этиологическое происхождение – травматическое событие, которое предполагает опасное для жизни воздействие, угрозу физической целостности себя и окружающих, и вызывает состояние сильного страха, беспомощности или ужаса [5, 6]. Люди, у которых развилось ПТСР вследствие психотравмирующих ситуаций, таких как военные действия, сексуальное или физическое насилие, стихийные бедствия, транспортные аварии, испытывают хронический психологический стресс, что может приводить к формированию поведенческих и психических отклонений [1, 4]. Постоянное переживание своих травм через навязчивые, возвращающиеся воспоминания, избегания мест и людей, напоминающих травмирующее событие, нервозность и ночные кошмары существенно мешают повседневной жизни и способствуют развитию коморбидных состояний [10].

К настоящему времени механизмы развития ПТСР остаются неясными. Собрано большое количество данных нейровизуализации и клинических исследований о конкретных структурных и функциональных изменениях в мозге пациентов и животных с ПТСР. Среди обнаруженных нарушений отмечают гиперактивацию миндалины, сокращение объема областей префронтальной коры и гиппокампа [5, 6]. При этом самыми повторяющимися нарушениями, коррелирующими с развитием ПТСР, являются патологическая морфология и снижение объема гиппокампа, а также повышение нейронального апоптоза в данной области [4, 5]. С другой точки зрения, уменьшение объема гиппокампа больше связано с самим травмирующим воздействием, чем с наличием или интенсивностью ПТСР [8]. Таким образом, несмотря на проведенные ранее исследования, вопрос о том, является ли структурное изменение объема гиппокампа биомаркером наличия ПТСР или предрасположенностью к его развитию, остается открытым [6, 10].

Экспериментально применять в исследованиях на людях стресс-факторы, способные вызвать ПТСР, этически недопустимо, поэтому при изучении механизмов развития данной патологии широко используют животные модели [2, 4]. Существуют различные животные модели формирования ПТСР, которые предполагают воздействие травматического стресса на животных с последующим исследованием системных и молекулярных механизмов влияния стресса на центральную нервную систему. Сроки изучения развития отклонений и изменений после индуцирования тревожного расстройства могут быть различными в зависимости от исследуемой структуры мозга (от получаса до нескольких месяцев). В целом, применение животных моделей тесно связано с проблемой адекватного моделирования тревожного расстройства на разных линиях крыс и воспроизводимостью результатов поведенческого фенотипирования [2, 7].

Цель данного исследования состояла в моделировании ПТСР у нелинейных крыс дикого типа и выявлении возможных структурных изменений в области гиппокампа на раннем сроке (10 дней) после формирования состояния тревожного расстройства.

Материалы и методы исследования

Объект исследования

Для изучения структурных изменений гиппокампа в поведенческой модели ПТСР были сформированы контрольная и экспериментальная группы животных, по семь особей в каждой (нелинейные крысы, самцы; масса тела 180–200 г, возраст – 1,5–2 месяца). Животных содержали в стандартных клетках по две крысы в каждой, при свободном доступе к пище и воде, световом режиме 12С:12Т и температуре 21 ± 2 °С.

Моделирование посттравматического стрессового расстройства

Для формирования у крыс симптомов, аналогичных при ПТСР, применяли модель «стресс-ресстрес» [1, 9] с внесением модификации. Модель включала два этапа: тяжелый травматический стресс (иммобилизация, вынужденное плавание, воздействие паров эфира до потери сознания) и через семь суток – напоминающий рестресс. Применяли следующий алгоритм формирования травматического стресса: иммобилизация животного в рестрейнере в течение 2 часов, вынужденное плавание в пластиковом цилиндре диаметром 20 см и высотой 50 см, заполненном водой на 1/3 (температура воды 25 °С) в течение 20 минут, 15 минут отдыха и просушивания в пустой клетке, затем помещение в камеру с эфиром до потери сознания. Через семь суток проводили рестресс, который включал последовательно 30-минутную иммобилизацию с добавлением воздействия эфиром как триггера, усиливающего развитие тревожного патологического состояния.

Поведенческое фенотипирование

Поведенческое фенотипирование проводили в приподнятом крестообразном лабиринте до начала формирования тревожного расстройства и на 7-й день после стресса перед проведением рестресса, контрольную группу оценивали один раз. Лабиринт располагался над полом на высоте (60 см) и состоял из двух закрытых (50×14 см) и двух открытых (50×14 см) рукавов с открытым верхом, а также центральной области на пересечении рукавов. Крысу помещали в центральную область головой по направлению к открытому рукаву и оставляли в лабиринте на 5 мин. Поведение животного в лабиринте регистрировали на видеокамеру (GoPro, частота дискретизации 50 кадров/сек), затем видеозапись обрабатывали при помощи программы Real Timer. Регистрировали основные поведенческие характеристики, такие как время пребывания в открытых и закрытых рукавах лабиринта, в центральной области, количество заходов в открытые и закрытые рукава, количество стоек без опоры и с опорой на стенки лабиринта, груминг и замирание. Вход в рукав засчитывался по задним лапам животного, когда оно пересекало границу между центром и рукавом всем телом. После проведения теста лабиринт дезинфицировали этанолом и оставляли на 15 минут.

Измерение объема гиппокампа

После декапитации животных образцы мозгов крыс были выделены через 10 дней после воздействия травмирующего стресса и зафиксированы для приготовления гистологических срезов в 4 % параформальдегиде. Перед приготовлением срезов за 24 ч до замораживания ткани мозга крысы материал помещали в 30 % раствор сахарозы. Срезы толщиной 50 мк готовили на криостате (Leica 1850, Germany) и окрашивали в соответствии с протоколом по авидин-биотиновой методике, располагали по предметным стеклам и заключали в NewMount. Сканирование образцов выполняли на микроскопе (KEYENCE BZ-9000, Japan). Обработку полученных изображений фронтальных срезов, выделение и измерение площади области гиппокампа производили в программе ImageJ, ориентируясь на атлас (Rat Brain – Paxinos G. and Watson C.), вычисление объема проводили в Microsoft Excel 2010. Результаты представлены c использованием стандартной ошибки среднего, достоверность различий оценивали по критерию Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты поведенческого фенотипирования экспериментальной группы крыс до и после индуцирования ПТСР по сравнению с контролем показали, что из всех рассматриваемых поведенческих характеристик наиболее показательным был критерий «время пребывания» для открытых и закрытых рукавов лабиринта, а также в центральной области. И в контрольной группе, и в экспериментальной до формирования ПТСР время, проведенное в указанных зонах крестообразного лабиринта, не различалось, что указывает на поведенческую однородность групп. После индуцирования ПТСР время нахождения в открытых рукавах и центральной области снижается, в то время как в закрытых рукавах возрастает. Различия значимы с применением стандартной ошибки среднего. Однако при использовании критерия Манна-Уитни, статистическая значимость различий не подтвердилась (рис. 1, «контроль-ПТСР», закрытые рукава, p = 0,14). Полученные нами результаты диссонируют с данными ряда исследований, в которых показано увеличение времени пребывания стрессированных крыс в центральной области, что, по мнению авторов, свидетельствует о трудностях крыс в выборе действия [2]. Такое несоответствие может иметь под собой несколько причин. Прежде всего, в исследованиях широко используют крыс линии Wistar, которые отличаются по поведению от нелинейных крыс, используемых нами: последние, возможно, обладают более мощным адаптивным потенциалом по отношению к стрессовым факторам. Кроме того, мы полагаем, что такие результаты могли быть получены из-за сокращения времени, отведенного нами на формирование ПТСР у животных, по сравнению со стандартными методиками, которые предполагают 3 недели, поскольку мы преследовали цель выяснить, насколько рано можно заметить различия в поведении у стрессированных нелинейных крыс.

sid1.tif

Рис. 1. Время нахождения крыс в различных частях лабиринта (mean ± SEM). По горизонтальной оси указаны области крестообразного лабиринта, по вертикальной оси отмечено время нахождения животных в соответствующих областях. Легенда: «Контроль» – контрольная группа, «до ПТСР» – экспериментальная группа до формирования ПТСР, «после ПТСР» – экспериментальная группа после формирования ПТСР

Стоит отметить, что количество заходов в рукава у крыс экспериментальной группы по сравнению с контролем значимо не изменилось, несмотря на имеющиеся различия между ними в закрытых рукавах (рис. 2, критерий Манна-Уитни, р = 0,64). Результаты показывают, что через 10 дней после травматического воздействия животные не снижают своей локомоторной активности в лабиринте, но эти данные соотносятся с исследованием [3], в котором общее количество заходов у крыс с ПТСР даже несколько выше, чем в контроле.

sid2.tif

Рис. 2. Общая активность (количество заходов в рукава) крыс в лабиринте (mean ± SEM). Легенда: «Контроль» – контрольная группа, «ПТСР» – экспериментальная группа после формирования ПТСР

Проведенное нами морфометрическое измерение объемов, как правого, так и левого гиппокампа показало отсутствие статистически значимых различий между контрольной и экспериментальной группами, несмотря на видимые различия при использовании параметрического анализа (рис. 3, критерий Манна-Уитни p > 0,99 – для левого гиппокампа, p = 0,07 – для правого гиппокампа). Это позволяет предположить, что либо за такой короткий промежуток времени никаких изменений в объеме гиппокампа происходить не должно, либо нелинейные крысы дикого типа, которых мы использовали в эксперименте, более устойчивы к стрессорным воздействиям, и данная модель неэффективна по отношению к ним.

sid3.tif

Рис. 3. Измерение объема гиппокампа (mean ± SEM). По вертикальной оси указан объем гиппокампа в правой и левой половине мозга (в мм3). Легенда: «Контроль» – контрольная группа, «ПТСР» – экспериментальная группа после формирования ПТСР

Заключение

Гиппокамп – одна из основных структур головного мозга, обеспечивающих реализацию механизмов памяти, поведенческих реакций, в том числе избегания стрессовых воздействий. Уменьшение объема гиппокампа отмечено в большом количестве работ, посвященных исследованию изменений структур мозга при ПТСР, которые выполнены с применением метода фМРТ [6, 7]. Полученные в нашем исследовании изменения в объеме гиппокампа не являются статистически значимыми, что, в сочетании с отсутствием достоверных изменений поведенческих характеристик и уровня тревожности у животных экспериментальной группы по сравнению с контролем, ставит под сомнение формирование ПТСР за короткий промежуток времени у нелинейных крыс. Уместно отметить, что модель «стресс-рестресс» была применена нами на крысах, имеющих значительно менее однородный генотип по сравнению с линейными лабораторными крысами, и, как следствие, усложнение протокола моделирования тревожного расстройства. Однако отмеченные различия в поведении экспериментальной группы до и после стрессирования позволяют предполагать успешность данной поведенческой модели при использовании крыс Wistar и увеличении временного периода после травматического воздействия [1–3].


Библиографическая ссылка

Сидорова М.В., Ваколюк И.А. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ГИППОКАМПА НА РАННЕМ СРОКЕ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО СТРЕССОВОГО РАССТРОЙСТВА У КРЫС // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 7-1. – С. 106-110;
URL: https://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=11703 (дата обращения: 26.01.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074