Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ИЗУЧЕНИЕ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА ИЗ КОРНЕЙ ПИОНА МОЛОЧНОЦВЕТКОВОГО

Ляпина М.Г. 1 Успенская М.С. 1
1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
В работе представлены экспериментальные данные по исследованию препарата антикоагулянта, выделенного из корней пиона молочноцветкового (P. lactiflora). Установлено, что при внутривенном введении в кровоток растительный препарат повышает антикоагулянтную и суммарную фибринолитическую активность как ферментативной, так и неферментативной природы в плазме крови на протяжении 3 ч после введения. Показано, что неферментативный фибринолиз обусловлен способностью препарата из пиона вызывать деполимеризацию фибрина, а ферментативный – вследствие выделения в кровоток из эндотелия сосудов тканевого активатора плазминогена. Препарат из пиона относится к нетоксичным антикоагулянтам, сочетающим ферментативный фибринолитический и фибриндеполимеризационный эффекты при поступлении в организм. Следовательно, исследованный нами препарат из корней пиона позволяет отнести его к антитромботическим средствам.
антикоагулянт из пиона
деполимеризация фибрина
тканевой активатор плазминогена
1. Гринкевич Н.И. Лекарственные растения. Справочное пособие. – М.: Высшая школа, 1991. – 398 с.
2. Криштанова Н.А., Сафонова М.Ю., Болотова В.Ц., Павлова Е.Д., Саканян Е.И. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств // Вестник ВГУ, сер. биология, химия, фармация. – 2005. – Т. 1. – С. 212–221.
3. Кудряшов Б.А., Ляпина Л.А., Кондашевская М.В., Ковальчук Г.А. Антикоагулянт из таволги вязолистной, его антитромботический и тромболитический эффекты // Вестн. Моск.ун-та. Сер.16. Биология. – 1990. – № 1. – С. 15–18.
4. Ляпина Л.А., Григорьева М.Е., Оберган Т.Ю., Шубина Т.А. Теоретические и практические вопросы изучения функционального состояния противосвертывающей системы крови. – М.: Адвансед Солюшнз, 2012. – 160 с.
5. Ляпина М.Г., Успенская М.С., Майстренко Е.С. О механизме антикоагулянтного действия экстракта из корней пиона молочноцветкового // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 11–6. – С. 1091–1093.
6. Успенская М.С., Мурашев В.В., Криницина А. Древовидные пионы в Ботаническом саду МГУ. Под ред. Мурашева В.В. – М.: Лесная страна, 2016. – 104 с.
7. Kondachevskaya M.V., Lyapina L.A,, Smolina T.Y. Antithrombotic and thrombolytic effects of root’s extract paeonia anomala // Haemostasis. – 1996. – V. 26. № 3. – P. 584–585.
8. Lee J.I., Lee H.S,, Jun W.J., Yu K.W., Shin D.H., Hong B.S., Cho H.Y., Yang H.C. Purification and characterization of antithrombotics from Syzygium aromaticum (L.) // Biol. Pharm. Bull. – 2001. – V. 24. № 2. – P. 181–187.
9. Sokolova E.V., Byankina A.O., Kalitnik A.A., Kim Y.H., Bogdanovich L.N., Solov’eva T.F., Yermak I.M. Influence of red algal sulfated polysaccharides on blood coagulation and platelets activation in vitro // J. Biomed. Mater. Res. – 2014. – V. 102, № 5. – P. 1431–1438.
10. Xiao C., Lian W., Zhou L., Gao N., Xu L., Chen J., Wu M., Peng W., Zhao J. Interactions between depolymerized fucosylated glycosaminoglycan and coagulation proteases or inhibitors.// Thromb Res. – 2016. – V. 146. – P. 59–68.

Проблема использования растений, способных оказывать разнообразное воздействие на организм, разрабатывается как за рубежом, так и у нас в стране.

Многие растения оказывают влияние на систему свертывания крови, так как содержат вещества или повышающие свертывание, или снижающие его [1]. Противосвертывающее действие некоторых растений связано с наличием в их составе полисахаридных компонентов [2], например, в таволге вязолистной [3], в цветках календулы [1], гвоздики [8]. В морских растениях (ламинарии японской) [9] выявлены компоненты, снижающие концентрацию фибриногена и агрегацию тромбоцитов крови, усиливающие активность антитромбина III, гепариновое время свертывания крови, а также повышающие фибринолиз по тесту времени лизиса эуглобулинов.

Особый интерес представляют экологически чистые растения, широко распространенные в мире и используемые в медицинской практике. К ним относится семейство пионов. Известен водный настой корня пиона уклоняющегося (Марьин корень – Paeonia anomala L.), используемый в медицинской практике как успокаивающее, противоэпилептическое, противокашлевое и обезболивающее средство. В корнях этого пиона помимо эфирных масел (1,1–1,59 %), крахмала (80 %), сахаров (10 %) содержатся также пеонол, салициловая кислота [6], которая может приводить к снижению агрегации тромбоцитов крови. Установлены антитромботические эффекты в экстрактах корней этого пиона [7]. Менее изучен другой вид пиона – молочноцветковый (P. lactiflora), в корнях которого также найдена салициловая кислота [6].

Цель нашего исследования – показать влияние биологически активных компонентов, выделенных из корней молочноцветкового пиона (P. lactiflora), на параметры свертывающей и противосвертывающей систем крови при внутривенном введении в организм животных и сравнить его эффекты с коммерческим низкомолекулярным гепарином.

Материалы и методы исследования

Биологически активные антикоагулянтные компоненты получали экстракцией измельченных до порошкообразного состояния корней пиона, экстракт освобождали от белков [5]. Высушенный препарат растворяли в 0,85 %-ном NaCl. Содержание гепарина в препарате определяли амидолитическим методом. В качестве препарата сравнения использовали коммерческий низкомолекулярный гепарин (НМГ) фирмы «Celsus». За 1 условную единицу (усл.ед.) гепарина принято 10 мкг определяемого гепарина, которые вызывают заметное повышение антикоагулянтной активности по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). Выявляли действие различных концентраций (по уровню или активности определяемого гепарина) двух препаратов – биологически активных компонентов из корней исследуемого пиона (КП) и препарата НМГ на внутренний путь свертывания крови в тесте АЧТВ.

В экспериментах на животных использовали стандартизованную дозу препарата КП, составляющую 37,5 усл.ед. гепарина в 0,5 мл 0,85 %-ного раствора NaCl. Опыты проводили на 40 белых лабораторных крысах-самцах массой тела 180–200 г в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации. Животные были разделены на три группы: первой группе (опыт 1, n = 12) вводили КП, второй группе (опыт 2, n = 8) – раствор НМГ в той же дозе и в том же объеме и третьей (контрольной, n = 12) – физиологический раствор (0,85 %-ный NaCl) в том же объеме. Введение препаратов и взятие крови осуществляли через яремную вену. Кровь на анализы брали при соотношении кровь: консервант как 9:1 спустя 10 и 180 мин после введения. В качестве консерванта использовали 3,8 %-ный раствор цитрата натрия. Кровь центрифугировали в течение 12 мин при 2000g. Получали бедную тромбоцитами плазму крови, в которой определяли антикоагулянтную активность по тестам АЧТВ, протромбинового времени (ПВ), тромбинового времени (ТВ), неферментативную фибринолитическую или фибриндеполимеризационную активность (ФДПА) на нестабилизированном фибрине и активность тканевого активатора плазминогена (ААП) на стандартном фибрине [4].

Результаты исследования и их обсуждение

В условиях in vitro была установлена практически одинаковая дозозависимость антикоагулянтных эффектов (в тесте АЧТВ) как биологически активных компонентов из КП, так и препарата сравнения – НМГ, которые содержали одинаковое количество определяемого нами гепарина (табл. 1).

Таблица 1

Антикоагулянтные эффекты по тесту АЧТВ (с) гепариновых компонентов из корней пиона Р. lactiflora (КП) и коммерческого НМГ (НМГ) в зависимости от концентраций содержащегося в них гепарина (М ± m)

Образцы

мкг/мл

АЧТВ,с

мкг/мл

АЧТВ, с

мкг/мл

АЧТВ, с

мкг/мл

АЧТВ, с

КП

0 – нет препарата

31,5 ± 1,6

1,0

37,0 ± 1,8*

10,0

48,0 ± 2,3**

50,0

67,2 ± 3.3**

НМГ

0 – нет

препарата

31,6 ± 1,6

1,0

36,8 ± 2.8

10,0

44,3 ± 2,5**

50,0

60,3 ± 3.9**

Примечание. Достоверность различий ** р < 0,01, *p < 0,05 по сравнению с контролем (отсутствие препаратов).

Как показали эксперименты, через 10 мин после внутривенного введения КП (опыт 1) резко увеличивается антикоагулянтная активность плазмы крови за счет удлинения АЧТВ и ПВ на 90–100 % соответственно, при этом ТВ практически не меняется, в опыте 2 при этом также повышается антикоагулянтная активность плазмы крови вследствие увеличения АЧТВ на 101 % и ПВ – на 100 %. В этот период времени в плазме крови крыс (опыт 1) обнаруживается значительное увеличение ФДПА на 110 % и повышение ААП на 45 %, в то время как в опыте 2 ФДПА увеличивается лишь на 23 %, а ААП, как и в опыте 1 – на 45 % (табл. 2).

Таблица 2

Антикоагулянтная ( с, %) и фибринолитическая (мм2, %) активность плазмы крови крыс после внутривенного введения биологически активных компонентов из корней пиона Р. lactiflora (опыт 1) и коммерческого НМГ (опыт 2) в дозе 37,5 усл.ед /200 г массы тела в динамике (через 10 и 180 мин) (М ± m)

Условия опыта

Антикоагулянтная активность, с ( %)

Фибринолиз, мм2 ( %)

АЧТВ

ПВ

ТВ

ФДПА

ААП

Норма. n = 8

34,1 ± 1,3

(103 %)

28,3 ± 2,2

(102 %)

15,4 ± 0,7

(105 %)

5,8 ± 0,8

(92 %)

25,0 ± 1,1

(98 %)

Контроль (n = 12) – через 10 мин

32,9 ± 0,9

(100 %)

27,7 ± 1,0

(100 %)

14,5 ± 0,8

(100 %)

6,3 ± 1,2

(100 %)

28,1 ± 1,3

(100 %)

Контроль через 180 мин

32,0 ± 1,4

(100 %)

29,7 ± 0,7

(100 %)

15,5 ± 1,8 (100 %)

7,3 ± 2,2

(100 %)

26,4 ± 1,5

(100 %)

Опыт 1 (n–12) – через 10 мин

62,2 ± 3,5**

(190 %)

55,2 ± 1,3**

(200 %)

16,5 ± 2,1

(113 %)

13,5 ± 1,7**

(210 %)

41,1 ± 2,4**

(145 %)

Опыт 1 – через 180 мин

58,2 ± 2,4**

(174 %)

47,2 ± 2,3**

(160 %)

14,8 ± 2,2

(108 %)

13,0 ± 2,4*

(177 %)

34,4 ± 2,8*

(153 %)

Опыт 2 (n–8) – через 10 мин

66,1 ± 4,9**

(201 %)

55,2 ± 1,0**

(200 %)

14,9 ± 2,0

(103 %)

7,8 ± 1,7

(123 %)

41,0 ± 2,4

(145 %)

Опыт 2 – через 180 мин

56,7 ± 2,5**

(172.5 %)

46,0 ± 3,4

(155 %)

16,5 ± 3,3

(107 %)

7,4 ± 0,9

(100 %)

41,0 ± 1,0

(145 %)

Примечание. Достоверность различий ** р < 0,01, *p < 0,05 по сравнению с контролем (введен 0,85 %-ный NaCl), АЧТВ– активированное частичное тромбопластиновое время, ПВ – протромбиновое время, ТВ – тромбиновое время, ФДПА – фибриндеполимеризационная активность, ААП – активность тканевого активатора плазминогена.

Эти результаты показали, что содержащиеся в КП биологически активные гепариноподобные компоненты влияют на внутренний механизм свертывания, подавляя активность факторов свертывания, в том числе фактора Ха. Подобные эффекты установлены и после действия препарата сравнения (опыт 2). В то же время удлинение ПВ под влиянием обоих препаратов свидетельствует об ингибиции каждым из них факторов протромбинового комплекса, в том числе фактора Ха. Через 180 мин после введения КП (опыт 1) или препарата сравнения НМГ (опыт 2) в плазме крови крыс сохранялся повышенный фон антикоагулянтной активности за счет удлинения АЧТВ на 74 и 72,5 % и ПВ на 60 и 55 % соответственно, при этом ТВ оставалось в пределах нормы в обоих случаях (опыт 1 и опыт 2). Одновременно в этот период времени наблюдалось достоверное повышение ФДПА только в опыте 1 (КП) на 77 % и ААП (и в опыте 1, и в опыте 2) – на 53–45 % соответственно (табл. 2). Эти данные указывали на значительное влияние КП и препарата сравнения на факторы как внутреннего, так и внешнего путей свертывания крови,и особенно на общий для этих путей свертывания фактор Ха. Следует отметить, что в отличие от препарата сравнения, КП способствовал усилению как неферментативной, так и ферментативной фибринолитической активности плазмы крыс. Неферментативный фибринолиз проявлялся через деполимеризацию фибрина, а ферментативный – путем повышения активности тканевого активатора плазминогена. Таким образом, биологически активные гепариноподобные компоненты КП оказывали в крови крыс ингибирующее действие на активность фактора Ха, а также препятствовали превращению фибриногена в фибрин или же в случае образования фибриновых сгустков осуществляли их быстрое растворение. У коммерческого препарата сравнения НМГ выявлена слабая ФДПА в отличие от исследуемого КП.

При анализе полученных данных необходимо отметить, что в корнях пионов содержится низкомолекулярный гепариноподобный компонент, представляющий собой соединение гепарина с пептидом (гликопептид) [3, 6]. Этот компонент по своим свойствам подобен НМГ животного происхождения. Как известно, НМГ ингибирует активность фактора Ха, но не ингибирует активность тромбина. По результатам наших исследований активный компонент, содержащийся в КП, также ингибирует фактор Ха, не влияя на активность тромбина. Наряду с этим этот активный компонент КП проявлял в организме фибринолитическое действие неферментативной и ферментативной природы и способствовал экспрессии из эндотелия сосудов тканевого активатора плазминогена.

Таким образом, внутривенное введение крысам гепариноподобных биологически активных компонентов КП, как и препарата сравнения НМГ, вызывает с первых минут после однократного введения гипокоагуляцию, которая сохраняется на протяжении 3 ч. Кроме того, антикоагулянт из КП в отличие от НМГ тормозит коагуляционные превращения фибриногена, замедляя процесс самосборки фибрина, о чем свидетельствует его значительная фибриндеполимеризационная активность, подобно фукозилированным гликозаминогликанам [10]. Процесс самосборки фибрина реализуется за счет электростатических взаимодействий биологически активных компонентов КП с фибрин-мономерами, а также фибрин-полимерами разной степени зрелости. Наиболее значительным оказывается взаимодействие КП с ранними стадиями самосборки фибрина. Наряду с этим нами показано, что в ответ на появление в кровотоке активного антикоагулянта из КП, как и препарата сравнения НМГ, происходит выделение в кровоток из сосудистого эндотелия тканевого активатора плазминогена, участвующего в повышении ферментативной фибринолитической активности плазмы крови. Эти факты указывают на необходимость детального исследования взаимодействия антикоагулянта из КП с компонентами, участвующими в процессах превращения фибриногена в фибрин.

Представленные данные свидетельствуют о перспективности изучения антикоагулянта из пиона молочноцветкового в качестве средства фармакологической коррекции повышенного уровня свертывания крови.

Заключение

На основании полученных в настоящей статье результатов можно заключить, что выделенный нами очищенный от белка препарат антикоагулянта из пиона молочноцветкового, подобно низкомолекулярному гепарину коммерческого производства, выделенному из тканей животных, при внутривенном введении в кровоток проявляет антикоагулянтную активность и способствует усилению ферментативных фибринолитических свойств плазмы крови за счет выброса в кровоток из эндотелия сосудов тканевого активатора плазминогена. В отличие от препарата сравнения НМГ низкомолекулярные гепариноподобные компоненты из корней пиона дополнительно оказывают значительную фибриндеполимеризационную активность в плазме крови. Итак, сходство двух препаратов заключается в практически одинаковой дозозависимости (по уровню гепарина) антикоагулянтного эффекта, в проявлении антифакторной Ха активности, отсутствии влияния на активность тромбина и в увеличении активности тканевого активатора плазминогена в крови. Различие двух препаратов заключается в том, что лишь активные компоненты из корней пиона проявляют заметную фибриндеполимеризационную активность в плазме крови. Полученный нами препарат из корней пиона может служить перспективным безопасным, экологически чистым антикоагулянтом с высоким фибриндеполимеризационным эффектом.


Библиографическая ссылка

Ляпина М.Г., Успенская М.С. ИЗУЧЕНИЕ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА ИЗ КОРНЕЙ ПИОНА МОЛОЧНОЦВЕТКОВОГО // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 10-1. – С. 82-85;
URL: https://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=11865 (дата обращения: 19.01.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074