Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Абдрахманов В.И. 1 Краснов В.Л. 2 Логутов В.И. 3 Орлов А.В. 2 Сахипов В.Р. 4

---

1 ООО «Ареал Медикал»

2 Дзержинский политехнический институт (филиал) Нижегородского государственного технического университета имени Р.Е. Алексеева

3 Дзержинский филиал Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

4 ООО «Гамма-Хим НН»

Представлены результаты исследования субстанции АСД-2Ф методами газожидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии. Подробно обсуждаются условия анализов. Обоснован выбор набора веществ-стандартов, которые могут быть и маркерами органических соединений, определяющих лечебно-профилактическое действие АСД-2Ф, и показателями качества субстанции. Установлено, что выдержка исходной субстанции при температуре 80 °C в течение трёх часов позволяет провести концентрирование органических веществ без их потери и добиться обнаружения в пробе значительного количества веществ, не обнаруживаемых без предварительного концентрирования. Показано, что совместное применение газожидкостной хроматографии с капиллярной колонкой ZB-FFAP и хромато-масс-спектрометрии с капиллярной колонкой НР-5 позволяет определить наличие около 170 пиков веществ, входящих в состав органической части субстанции АСД-2Ф. Найдена концентрация двадцати шести органических веществ-стандартов, входящих в состав органической части субстанции АСД-2Ф. Суммарное содержание этих веществ составляет около 50 % от общего количества органических веществ в АСД-2Ф, причём более 40 % составляют семь легкодоступных веществ-маркеров, среди которых четыре ациклических соединения (уксусная и масляная кислоты и их амиды) и три азотсодержащих гетероциклических соединения (2-пиперидинон; 5,5-диметилгидантоин и 5-метил-5-этил-гидантоин). Впервые установлено присутствие среди органических веществ субстанции значительного количества семи циклических дипептидов и их производных, таких как: 3,6-диметил-2,5-дикетопиперазин, 3-изопропил-6-метил-2,5-дикетопиперазин, 3,6-диизопропил-2,5-дикетопиперазин, 3,6-диизобутил-2,5-дикетопиперазин, 3-бензил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин, N-ацетил -3-метил-1,4-диазабицикло-[4.3.0]-нонан-2,5-дион, а также 1,3-Диметилдигидро-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндион, и подтверждено наличие в препарате АСД-2Ф двух найденных ранее гетероциклических дипептидов пролина: 3-изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазина и 5,10-диэтокси-2,3,7,8-тетрагидро-1Н,6Н-дипирроло-[1,2-a;1’,2’-d]-пиразина.

Статья в формате PDF

0 KB

химический состав

антисептик-стимулятор Дорогова

субстанция АСД-2Ф

газожидкостная хроматография

хромато-масс-спектрометрия

вещества-стандарты

1. Абдрахманов В.И., Сахипов В.Р., Краснов В.Л. Исследование химического состава препарата АСД-2Ф // Проблемы современной науки и образования. 2015. № 11 (41). С. 58–64.

2. Енгашев С.В., Сидорин Д.Н., Рогова Н.В., Ремизова  Н.Ю., Енгашева И.В. Способ получения стабилизированной формы антисептика-стимулятора Дорогова – фракции 2 (АСД-2) // Патент РФ № 2494750. Патентообладатель ООО «НВЦ Агроветзащита». 2013. Бюл. № 28.

3. Енгашев С.В., Абдрахманов В.И., Сахипов В.Р., Краснов В.Л., Кондрашкин Е.М., Логутов В.И., Дорогова  О.А., Енгашева Е.С., Абрамов В.Е. Концентрированная фармацевтическая композиция и способ её получения // Патент РФ № 2657775. Патентообладатель ООО «НВЦ Агроветзащита». 2018. Бюл. № 17.

4. Hydrothermal liquefaction of waster water algae mixtures into bio-grude oil. Wan-TingChen, Urbana, Illinois 2013, 83 p. Р. 52–54.

5. Васина Я.А., Смельцова И.Л., Фаерман В.И., Яблоков В.А. Продукты твёрдофазного термического превращения L-α-аминокислот в вакуумированной системе // Universum: Химия и биология: электрон. научн. журн. 2016. № 11 (29). [Электронный ресурс]. URL: htth://7universum.com/ru/nature/archive/item/3827 (дата обращения: 15.04.2019).

6. Смельцова И.Л., Зеляев И.А., Митрофанова С.В. Термическая стабильность алифатических аминокислот // Естественные и математические науки в современном мире. 2012. № 1. С. 145–151.

7. Chaalaand A., Roy C. Recycling of Meat and Bone Meal Animal Feed by Vacuum Pyrolysis. Depatmentde Genie Chimique, UniversityLaval, Santa-Foy, Quebec, Canada/Environ. Sci. Technol. 2003. V. 37 (19). Р. 4517–4522.

В настоящее время продолжает оставаться актуальным вопрос определения химического состава ветеринарной субстанции АСД-2Ф (в дальнейшем – субстанции).

Известно [1], что с химической точки зрения АСД-2Ф представляет раствор органических веществ – продуктов совместного пиролиза белков и жиров животного происхождения – в водно-аммонийном буферном растворе, причём именно их определение вызывает наибольшие затруднения.

Определенных успехов в решении данной задачи достигли авторы [2], обнаружившие методом хромато-масс-спектроскопии в составе органической части АСД-2Ф около 120 индивидуальных органических веществ. Однако отсутствие фактических данных по методике проведения эксперимента не позволяет в полной мере применять полученные результаты на практике.

Цель работы: исследование химического состава субстанции АСД-2Ф и её концентратов методами газожидкостной хроматографии и хромато-масс-спектроскопии.

Материалы и методы исследования

Во всех опытах использовали образцы субстанции АСД-2Ф, произведенной ООО «Ареал Медикал», а также образцы концентратов субстанции (в дальнейшем – органическая часть, или ОЧ), приготовленные по разработанному нами ранее способу [3].

Газожидкостная хроматография

Подготовку пробы субстанции АСД-2Ф проводили следующим образом: в пластиковую пробирку для центрифугирования объёмом 15 мл пипеткой помещали 0,5 г субстанции, после чего туда же добавляли 10 мл этанола. Ввиду образования суспензии из-за выпадения осадка углеаммонийных солей пробирку центрифугировали в течение 10 мин при скорости вращения 3500–3900 об/мин, после чего из осветлённой части отбирали пробу для анализа.

ОЧ получали концентрированием органических веществ субстанции в соответствии с [3] упариванием образцов исходной субстанции в электрическом шкафу при температурах 60, 80, 100 °С до прекращения убыли веса. Масса органической части обычно составляла 5,5÷7 % от исходной при времени нагрева от 2,5 ч (для 100 °С) до 10 ч (для 60 °С).

После окончания упаривания готовили раствор концентрата (ОЧ) в этаноле из расчёта 10 мл растворителя на 0,5 г подготовленной пробы.

В качестве стандартов использовали реактивы с содержанием основного вещества не менее 95,0 %, причём значительное количество составили стандартные образцы для хроматографии, закупленные в российских фирмах. Такие вещества, как 2-пироллидинон, 2-пиперидинон, 3-метилбутанамид, 2-амино-3-метилпиридин, 5,5-диметилгидантоин, 5-этил-5-метилгидантоин, произведённые Асros Organics, 3-изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин, произведенный фирмой Santa Crus Biothechnology, были предоставлены НВЦ «Агроветзащита».

Исследование проводили на хроматографе Хроматэк-Кристалл-5000.1 2003 г. выпуска в комплектации: испаритель капиллярный, детектор пламенно-ионизационный и капиллярная колонка ZB-FFAP 50 м×0,32 мм×0,50 µм. Режим работы хроматографа: температура испарителя 250 °С, температура ПИД 250 °С, начальная температура колонки 145 °С, выдержка начальной изотермы 1 мин, скорость подъема температуры колонки 10 град/мин, конечная температура колонки 225 °С. Газ-носитель гелий в режиме поддержания постоянного давления перед колонкой 150 КПа, коэффициент деления потока 1/30, режим экономии газа. Газовый режим ПИД: расход водорода 30 мл/мин, расход воздуха 300 мл/мин, поддув инертного газа (гелия) 30 мл/мин. Объем вводимой в испаритель пробы 1 мкл. Общая длительность анализа 70 мин.

Выбор FFAP в качестве фазы капиллярной колонки был обусловлен тем, что значительное число индивидуальных веществ АСД-2Ф являются полярными азотсодержащими соединениями с молекулярной массой до 150–200 углеродных единиц, что позволяло ожидать достаточно качественное разделение компонентов смеси.

Хромато-масс-спектроскопию (ГХ-МС) образцов АСД-2Ф проводили на газовом хроматографе Shimadzu GC-2010 Plus, оборудованном пламенно-ионизационным детектором, масс-детектором GCMS-QP2020 и капиллярной колонкой НР-5 30м×0,32мм×0,25 мкм. Режим проведения анализа: температура испарителя 250 °С, температура ПИД 250 °С, температура ионного источника 210 °С, температура интерфейса 210 °С, температурная программа термостата колонки – 140 °С 15 мин, нагрев 10 °С/мин до 240 °С, общее время анализа 35 мин. Газ-носитель гелий в режиме постоянного давления перед колонкой 53 кПа, коэффициент деления потока 1/20, расход водорода 40 мл/мин, воздуха 400 мл/мин. Режим работы масс-детектора: температура ионного источника 210 °С; температура интерфейса 210 °С, скорость сканирования – 1425, интервал сканируемых масс – от m/z 30 до m/z 450, скорость развертки одного цикла – 0,3 с, напряжение детектора – 0,9 кВ, устранение эффекта растворителя – 1,5 мин.

Выбор фенил (5 %)полиметилсилоксана в качестве фазы капиллярной колонки был обусловлен тем, что данная фаза является менее полярной и более высокотемпературной, чем FFAP. Это должно было позволить получить на хроматограмме пики веществ с большей молекулярной массой, чем на колонке с FFAP.

Анализу подвергали раствор ОЧ АСД-2Ф в этаноле (0,5г в 10 мл соответственно), полученной в результате упаривания исходных образцов в течение 3 ч при температуре 80 °С.

Расшифровку полученных масс-спектров проводили с использованием программного обеспечения GCMS PostrunAnalysis. Идентификацию компонентного состава образцов проводили сравнением масс-спектра компонента, присутствующего в пробе, с его библиотечным масс-спектром (базы данных библиотек – NIST-14 и NIST-14s).

Результаты исследования и их обсуждение

В результате анализа непосредственно субстанции АСД-2Ф методом ГЖХ были получены хроматограммы, содержащие до 80 пиков, а концентрирование субстанции позволило в тех же условиях получить хроматограммы, содержащие до 140 пиков индивидуальных органических веществ.

При обработке полученных хроматограмм учитывали лишь пики с соотношением сигнал/шум более 10. При увеличении соотношения сигнал/шум до 20 и 50 количество пиков уменьшалось лишь на 3–10 %, а суммарная площадь пиков уменьшалась лишь на 5–20 % соответственно.

Идентификация и количественное определение содержания некоторых компонентов субстанции проводились на основе модельных (искусственно приготовленных) смесей, содержащих 26 компонентов, доступных в приобретении и распределенных по всей протяжённости получаемой хроматограммы. Градуировку хроматографа проводили по 4–5 смесям в диапазоне концентраций веществ-стандартов от 0,05 до 8 % мас.

В табл. 1 представлены основные результаты этих исследований.

Из данных табл. 1 видно, что использование для разделения колонки ZB-FFAP позволило установить более 50 % мас. органических веществ, входящих в состав субстанции АСД-2Ф.

Таблица 1

Влияние условий упаривания на содержание органических веществ в концентрате АСД-2Ф

Набор веществ-стандартов, включающий представителей самых различных групп органических соединений и представленный в табл. 1, практически исключает возможность фальсификации препарата. Одновременно нельзя не отметить, что для реализации метода анализа в производственных условиях достаточно использовать нескольких маркерных веществ, отличающихся высоким содержанием в субстанции, легкодоступных при приобретении, а также достаточно стабильных при хранении.

Эти вещества выделены в таблице «жирным» шрифтом: уксусная кислота, масляная кислота, ацетамид, пропионамид, 2-пиперидинон, 5,5-диметилгидантоин, 5-метил-5-этилгидантоин, причём их суммарная концентрация составляет более 40 % от массы ОЧ.

Анализ этих данных с точки зрения химического состава ОЧ также показывает, что значительное количество органических веществ АСД-2Ф относятся к жирным органическим кислотам, а также их амидам. Суммарная концентрация органических кислот практически равна 1 %, так же как и амидов данных кислот.

Следует учитывать, что вещества, определяемые на хроматограмме как органические кислоты, существуют в исходном АСД-2Ф в виде их соответствующих аммонийных солей. Поэтому нами было проведен специальный опыт, доказывающий, что в представленных условиях анализа кислоты и их аммонийные соли в исходной пробе дают одинаковый результат хроматографического анализа.

Достаточно много в АСД-2Ф индивидуального вещества 2-пиперидинона, концентрация которого составляет около 0,4 %.

Особый интерес представляют 5,5-алкилпроизводные гидантоинов, имеющие высокую суммарную концентрацию (около 1 %) и обладающие подтверждённым антисептическим действием

Рассматривая изменение химического состава образцов АСД-2Ф в результате выдержки при различных температурах можно отметить, что упаривание образцов АСД-2Ф даже при относительно невысокой (до 60 °C) температуре позволяет осуществить концентрирование органических веществ субстанции. Так, например, содержание производных гидантоинов в концентрате повышается в 15 раз по сравнению с исходной субстанцией.

При выдержке образцов при температуре 100 °C начинается интенсивное испарение легколетучих веществ и воды, в результате чего на хроматограмме концентрата наблюдается менее половины из использованных 26 веществ-стандартов.

Таким образом, наиболее подходящими условиями подготовки субстанции АСД-2Ф для производственного ГЖХ-анализа является, по мнению авторов, концентрирование органических веществ при температуре 80 °C в течение 3 ч.

В табл. 2 представлены результаты хромато-масс-спектроскопии субстанции АСД-2Ф (условные обозначения: t – время удерживания, мин; S – относительная площадь сигнала, %; SI – степень совпадения с данными библиотеки; [2, 4] литературные результаты).

Таблица 2

Результаты ГХ-МС субстанции АСД-2Ф

Выбор индивидуальных веществ производили не только по степени соответствия характеристик спектра соответствующим библиотечным данным, но и с учётом существующих представлений [5–7] о возможном механизме совместного пиролиза белков и жиров животного происхождения в безвоздушной среде при температуре в диапазоне 200–500 °С.

При этом основной чертой механизма пиролиза мы считали возможное образование из аминокислот, представленных в животных белках, циклических и линейных дипептидов, а также их производных. Предполагали, что дипептиды могли бы образоваться из таких аминокислот, как глицин, лейцин, фенилаланин, аланин, валин, пролин, гидроксипролин, изолейцин.

Однако до сих пор по данным [2, 4] удалось обнаружить в аналогичных продуктах пиролиза лишь 3-изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин и эфирное производное дипептида 5,10-диэтокси-2,3,7,8-тетрагидро-1Н,6Н-дипирроло [1,2-a; 1’,2’-d] пиразин. Поэтому мы обоснованно предполагали, что в спектре анализируемых образцов АСД-2Ф должны присутствовать и иные дипептиды. Наличие этих веществ не удалось определить методом ГЖХ с колонкой FFAP, в то время как ГХ-МС с использованием колонки НР-5 позволило определить наличие десяти дипептидов и их эфиров.

Для органической части всего нами были определены 150 веществ, причём 53 вещества, представленные в табл. 2, имеют относительную площадь сигнала более 0,1 %, а сумма относительных площадей их пиков составляет более 98 %.

Эти вещества распределяются по нескольким основным группам: более 90 % всех веществ (по суммарной относительной площади сигнала) представляют азотосодержащие вещества, в том числе:

– амиды карбоновых кислот и амины – более 7 %;

– алкилгидантоины – 32 %;

– дипептиды, в том числе циклические – 16 %.

Остальные вещества являются отдельными представителями лактамов и других азотосодержащих гетероциклов, производными аминокислот и карбоновых кислот. Жирным шрифтом в таблице выделены вещества, возможность использования которых в качестве маркеров химического состава АСД-2Ф обсуждалась нами при рассмотрении данных табл. 1.

В диапазоне времени удерживания 8–32 минуты, то есть после 5-метил-5-этилгидантоина, методом ГХ-МС были найдены около 30 веществ с суммарной относительной площадью пиков более 30 %, которые не наблюдались на хроматограмме при проведении определения на колонке FFAP.

Выводы

1. Показано, что совместное применение газожидкостной хроматографии с капиллярной колонкой ZB-FFAP и хромато-масс-спектрометрии с капиллярной колонкой НР-5 позволяет определить наличие около 170 пиков веществ, входящих в состав органической части субстанции АСД-2Ф.

2. Определена концентрация 26 органических веществ-стандартов, входящих в состав органической части субстанции АСД-2Ф. Суммарное содержание этих веществ составляет около 50 % (мас.) от общего количества органических веществ в АСД-2Ф, причём более 40 % (мас.) составляют семь легкодоступных веществ-маркеров (уксусная и масляная кислоты, а также их соответствующие амиды; 2-пиперидинон; 5,5-диметилгидантоин и 5-метил-5-этилгидантоин).

3. Впервые установлено значительное количество среди органических веществ субстанции циклических дипептидов и их производных, таких как 3,6-диметил-2,5дикетопиперазин, 3-изопропил-6-метил-2,5-дикетопиперазин, 3,6-диизопропил-2,5дикетопиперазин, 3,6-диизобутил-2,5-дикетопиперазин, 3-бензил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин, N-ацетил-3-метил-1,4-диазабицикло-[4.3.0]-нонан-2,5-дион, а также 1,3-диметилдигидро-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндион, и подтверждено наличие в препарате АСД-2Ф двух найденных ранее гетероциклических дипептидов пролина: 3-изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазина и 5,10-диэтокси-2,3,7,8-тетрагидро-1Н,6Н-дипирроло-[1,2-a; 1',2'-d]-пиразина.

Выражаем благодарность канд. хим. наук А.Л. Есиповичу, доценту кафедры «Химическая технология» Дзержинского политехнического института (филиала) НГТУ имени Р.Е. Алексеева за участие в проведении анализов АСД-2Ф методом ГХ-МС и помощь в обсуждении полученных результатов, а также канд. ветеринар. наук Е.С. Енгашевой, начальнику отдела НВЦ «Агроветзащита», канд. хим. наук В.А. Кашаеву, нач. отдела АО «ГосНИИ «Кристалл» за помощь в подборе и приобретении образцов стандартов химических веществ и обсуждении результатов.

Библиографическая ссылка