Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Созарукова М.М. 1 Проскурнина Е.В. 2

---

1 ФГБУН «Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова» Российской академии наук

2 ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Макрофаги – клетки иннатного иммунитета, продуцирующие активные формы кислорода, которые выполняют прежде всего сигнальную функцию и участвуют в активации, поляризации и гибели макрофагов. Разработка протоколов оценки радикал-продуцирующей функции макрофагов имеет значение для изучения их физиологии в норме и при патологии. Продемонстрирована возможность использования метода кинетической хемилюминесценции для оценки радикал-продуцирующей функции культивируемых макрофагов. Первичная культура макрофагов получена из крови трех практически здоровых доноров по стандартной методике. Предложен протокол, основанный на регистрации полной кинетики хемилюминесценции, стимулированной как единичными стимулами форбол-12-миристат-13 ацетатом (ФМА) и N-формилметионил-лейцил-фенилаланином (фМЛФ), так и двумя последовательными стимулами в присутствии люминола. Показано, что ответ на единичные стимулы характеризуется аналогичной кинетикой и сопоставимыми амплитудами, что позволяет выбрать любой из имеющихся стимулов, а двухстадийная последовательная стимуляция ФМА + фМЛФ не имеет преимуществ перед одностадийной стимуляцией. С помощью многоканального хемилюминометра целесообразно провести регистрацию кинетики спонтанной и стимулированной хемилюминесценции в течение не менее 450 мин. В качестве аналитического параметра может быть использована площадь под кривой хемилюминесценции и коэффициент стимуляции, равный отношению светосуммы стимулированной хемилюминесценции к светосумме спонтанного ответа.

Статья в формате PDF

768 KB

культивируемые макрофаги

активные формы кислорода

хемилюминесценция

1. Manea A., Manea S.A., Gan A.M., Constantin A., Fenyo I.M., Raicu M., Muresian H., Simionescu M. Human monocytes and macrophages express NADPH oxidase 5; a potential source of reactive oxygen species in atherosclerosis. Biochem Biophys Res Commun. 2015. Vol. 461. No. 1. P. 172–179.

2. Tavakoli S., Asmis R. Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclerosis. Antioxid Redox Signal. 2012. Vol. 17. No. 12. P. 1785–1795.

3. Covarrubias A., Byles V., Horng T. ROS sets the stage for macrophage differentiation. Cell Res. 2013. Vol. 23. No. 8. P. 984–985.

4. Tan H.Y., Wang N., Li S., Hong M., Wang X., Feng Y. The Reactive Oxygen Species in Macrophage Polarization: Reflecting Its Dual Role in Progression and Treatment of Human Diseases. Oxid Med Cell Longev. 2016. Vol. 2016. P. 2795090.

5. Zaloudikova M. [NADPH-oxidase and the reactive oxygen species production by macrophages]. Cesk Fysiol. 2012. Vol. 61. No. 2. P. 51–56.

6. Otsuka R., Seino K.I. Macrophage activation syndrome and COVID-19. Inflamm Regen. 2020. Vol. 40. P. 19.

7. Allen R.C., Loose L.D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem Biophys Res Commun. 1976. Vol. 69, № 1. P. 245–52.

8. Beall G.D., Repine J.E., Hoidal J.R., Rasp F.L. Chemiluminescence by human alveolar macrophages: stimulation with heat-killed bacteria or phorobol myristate acetate. Infect Immun. 1977. Vol. 17. No. 1. P. 117–20.

9. Holian A., Daniele R.P. Stimulation of oxygen consumption and superoxide anion production in pulmonary macrophages by N-formyl methionyl peptides. FEBS Lett. 1979. Vol. 108. No. 1. P. 47–50.

10. Hall C.J., Sanderson L.E., Crosier K.E., Crosier P.S. Mitochondrial metabolism, reactive oxygen species, and macrophage function-fishing for insights. J Mol Med (Berl). 2014. Vol. 92. No. 11. P. 1119–1128.

11. Образцов И.В., Годков М.А., Полимова А.М., Дёмин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Оценка функциональной активности нейтрофилов цельной крови методом двухстадийной стимуляции: новый подход к хемилюминесцентному анализу // Российский иммунологический журнал. 2015. T. 9 (18). № 4. C. 418–425.

12. Образцов И.В., Годков М.А., Кулабухов В.В., Владимирова Г.А., Измайлов Д.Ю., Проскурнина Е.В. Ранняя диагностика ожогового сепсиса: опыт применения нового хемилюминесцентного метода анализа функциональной активности нейтрофилов с двухстадийной стимуляцией // Общая реаниматология. 2017. T. XIII. № 1. C. 40–51.

13. Vogt K.L., Summers C., Chilvers E.R., Condliffe A.M. Priming and de-priming of neutrophil responses in vitro and in vivo. Eur J Clin Invest. 2018. V. 48 Suppl 2. P. e12967.

14. Glass C.K., Natoli G. Molecular control of activation and priming in macrophages. Nat Immunol. 2016. Vol. 17.No. 1. P. 26–33

Стимулированные макрофаги продуцируют активные формы кислорода (АФК) за счет активации НАДФН-оксидазы, которая собирается на плазматической мембране из цитозольных белковых компонентов [1]. Помимо бактерицидного эффекта АФК участвуют в передаче сигналов макрофагов, которые контролируют дифференцировку, активацию, поляризацию и гибель моноцитов и макрофагов [2, 3]. Популяции макрофагов являются гетерогенными, что связано с их возможностью поляризоваться в различные функциональные фенотипы в зависимости от внешних сигналов, при этом ключевое значение имеют АФК, что дает возможность воздействия на этот процесс при помощи антиоксидантов [4]. Избыточная продукция макрофагальных АФК может вызвать поражение ткани [5], при новой коронавирусной инфекции этот процесс имеет большое патогенетическое значение [6]. Таким образом, изучение радикал-продуцирующей активности макрофагов имеет большое теоретическое и практическое значение.

Для определения уровня продукции активных форм кислорода давно используется метод хемилюминесценции в присутствии люминола [7]. В качестве стимулов макрофагов предложены форбол-12-миристат-13-ацетат [8], N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (фМЛФ) [9]. Макрофагальные активные формы кислорода представлены прежде всего супероксидным анион-радикалом и пероксидом водорода, а также митохондриальными АФК [10]. Хемилюминесцентные методы широко используются для оценки продукции АФК нейтрофилами. В подавляющем большинстве случаев используется одностадийная стимуляция, хотя двухстадийная стимуляция (ФМА и фМЛФ) позволяет значительно повысить чувствительность и информативность хемилюминометрической методики [11].

Цель исследования – изучить возможности одностадийной и двухстадийной стимуляции для изучения радикал-продуцирующей функции культивированных макрофагов и предложить параметры, характеризующие указанную функцию.

Материалы и методы исследования

Получение культуры макрофагов человека. Первичная культура моноцитов-макрофагов была получена из крови трех практически здоровых доноров (Д.1, Д.2, Д.3) в возрасте 40 ± 3 лет. Кровь была отобрана из локтевой вены после 12 ч голодания в вакуумные пробирки с гепарином лития (12–30 МЕ). Форменные элементы крови осаждали центрифугированием при 1600 об/мин (центрифуга Beckman GRP, США) с последующим отделением плазмы. Клетки суспендировали в изотоническом фосфатном буферном растворе (рН 7,4). Лейкоцитарную фракцию выделяли в градиенте плотности фиколла (ПанЭко, плотность 1,077 г/см3), центрифугируя в течение 30 мин при 1600 об/мин. Полученные клетки трижды отмывали фосфатным буферным раствором (1600 об/мин, 10 мин) и суспендировали в среде X-Vivo 10 (Lonza, Бельгия). Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Клетки рассаживали на стекла в чашки Петри (105 клеток на 1 см2 поверхности) и выдерживали в СО2-инкубаторе (5 % СО2, 95 % воздуха) при температуре 37 °C и 100 % влажности не менее 12 ч. После удаления неадгезировавших клеток оставшиеся моноциты-макрофаги инкубировали в течение суток в среде X-Vivo 10 в СО2-инкубаторе. Полученную клеточную культуру трехкратно промывали фосфатным буферным раствором и суспендировали (106 клеток в 1 мл) в растворе Хенкса (рН 7,4), содержащем 2 ммоль/л HEPES.

Хемилюминесцентный метод оценки радикал-продуцирующей функции макрофагов. Для изучения радикал-продуцирующей функции макрофагов использовали различные протоколы в присутствии люминола как активатора. № 1 – спонтанная хемилюминесценция, № 2 – хемилюминесценция, стимулированная форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА), № 3 – хемилюминесценция, стимулированная N-формилметионил-лейцил-фенилаланином (фМЛФ), № 4 – последовательная стимуляция ФМА и фМЛФ.

Регистрацию хемилюминесценции проводили на хемилюминометре Lum-1200 («ДИСофт, Россия), позволяющем одновременно проводить анализ в 12 кюветах. В кювету, содержащую раствор Хенкса, стабилизированный HEPES (450 мкл) и люминол (конечная концентрация 45 мкМ) (все реагенты Sigma-Aldrich, США) помещали 100 мкл культуры макрофагов (100 тыс. клеток) и регистрировали спонтанную хемилюминесценцию в течение 10 мин, затем вносили 50 мкл дистиллированной воды (протокол № 1), или ФМА (50 нг/мл) (протокол № 2), или фМЛФ, (10 мкМ) (протокол № 3), или праймирующий стимул ФМА (50 нг/мл) (протокол № 4). После 15 мин инкубации в кювету № 4 вносили второй стимул фМЛФ (10 мкМ). Хемилюминограммы регистрировали не менее 450 мин. Макрофаги одного донора анализировали одновременно по четырем протоколам в трех повторах. Рассчитывали амплитуду ответа (максимальное значение хемилюминесценции) и светосумму сигнала (площадь под кривой), пропорциональную количеству АФК, продуцируемых макрофагами.

Результаты исследования и их обсуждение

Спонтанная хемилюминесценция в присутствии люминола характеризует базальную (фоновую) радикал-продуцирующую активность макрофагов, при этом свечение отражает прежде всего продукцию пероксида водорода. Хемилюминограммы приведены на рис. 1.

Из данных следует, что спонтанная хемилюминесценция развивается в течение длительного времени (более 7 ч), хемилюминограмма имеет вид кривой с максимумом, причем кинетика для разных доноров различается. Для количественной оценки этой функции целесообразно проводить интегрирование всей кривой и вычислять как общие, так и удельные (деленные на число макрофагов) показатели (табл. 1).

Полный ответ на фМЛФ развивается в течение такого же времени, как и спонтанный ответ (порядка 400 мин), однако пиковое значение достигается несколько быстрее (за 100–200 мин) (рис. 3). Кинетика ответа на фМЛФ аналогична кинетике ответа на ФМА, однако интенсивность ответа в несколько раз меньше (табл. 3).

К основным результатам работы можно отнести следующие факты: 1) ответ на единичные стимулы ФМА или фМЛФ характеризуется аналогичной кинетикой и сопоставимыми интенсивностями; 2) двухстадийная стимуляция не имеет преимуществ перед одностадийной.

Такой отклик макрофагов отличается от ответа нейтрофилов на стимулы, где ответ на ФМА и фМЛФ характеризуется различной кинетикой, а двойная последовательная стимуляция в присутствии люминола приводила к значительному (на порядки) увеличению интенсивности ответа нейтрофилов по сравнению с единичным стимулом ФМА или фМЛФ [12]. Усиление ответа на рецепторный стимул (фМЛФ) является результатом праймирования первым стимулом ФМА, который проникает в клетку путем диффузии и стимулирует протеинкиназный путь сборки НАДФН-оксидазы [13]. В макрофагах иные механизмы праймирования и активации [14], что приводит к различиям в ответе на стимулы и в кинетике этого ответа.

В работе для анализа активности макрофагов предложены протоколы, которые были ранее разработаны для анализа функциональной активности нейтрофилов. Одновременная реализация этих протоколов позволит провести анализ в идентичных условиях, что даст возможность адекватно сравнить радикал-продуцирующую активность нейтрофилов и культивируемых макрофагов, полученных из одной пробы крови. В перспективе целесообразно применить описанные протоколы для изучения активности моноцитов крови в сравнении с активностью культивируемых макрофагов.

Заключение

Предложен протокол оценки радикал-продуцирующей функции культивируемых макрофагов с использованием метода кинетической хемилюминесценции с единичным стимулом (ФМА или фМЛФ) в присутствии люминола. В качестве аналитического параметра целесообразно использовать площадь под кривой хемилюминесценции, регистрируемой не менее 450 мин.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, тема № 0400-2020-008.

Библиографическая ссылка