Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,570

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРИТЕРПЕНОВОГО ГЛИКОЗИДА КУКУМАРИОЗИДА А2-2 С МЕМБРАННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ МАКРОФАГОВ МЫШИ

Пислягин Е.А. 1 Юрченко Е.А. 1 Горпенченко Т.Ю. 2 Давыдова В.Н. 1 Аминин Д.Л. 1
1 ФГБУ Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН
2 ФГБУ Биолого-почвенный институт ДВО РАН
Исследован молекулярный механизм иммуностимулирующего действия тритерпенового гликозида кукумариозида А2-2 из дальневосточной голотурии Cucumaria japonica. С помощью анализа флуоресцентного изображения клеток изучено взаимодействие кукумариозида А2-2 с мембранными рецепторами перитонеальных макрофагов мыши, главным образом с пуриновыми рецепторами Р2Х семейства (как потенциальными мембранными мишенями действия гликозида). Проведено фармакологическое типирование рецепторов и ионных каналов различными блокаторами и модуляторами Са2+ транспорта. Методом проточной цитофлуориметрии и FACS-анализа установлен композиционный состав клеток, входящих в популяцию иммунокомпетентных клеток мышей и принимающих участие в иммунном ответе на воздействие гликозида.
Тритерпеновые гликозиды голотурий
иммуномодулирующая активность
макрофаги
молекулярный механизм действия
пуриновые рецепторы
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. – М.: Мир. 1983. ‒ 264 c.
2. Aminin D.L., Koy C., Dmitrenok P.S., Müller-Hilke B., Koczan D., Arbogast B., Silchenko A.A., Kalinin V.I., Avilov S.A., Stonik V.A., Collin P.D., Thiesen H.J., Deinzer M.L., Glocker M.O. // Journal of Proteomics. ‒ 2009. Vol. 72, № 5. – P. 886–906.
3. Beigi R.D., Dubyak G.R. Endotoxin activation of macrophages does not induce ATP release and autocrine stimulation of P2 nucleotide receptors // Journal of Immunology. ‒ 2000. Vol. 165, № 12. – P. 7189–7198.
4. Burnstock G., Williams M. P2 purinergic receptors: Modulation of cell function and therapeutic potential // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. ‒ 2000. Vol. 295, № 3. – P. 862–869.
5. Di Virgilio F., Chiozzi P., Ferrari D., Falzoni S., Sanz J.M., Morelli A., Torboli M., Bolognesi G., Baricordi O.R. Nucleotide receptors: An emerging family of regulatory molecules in blood cells // Blood. – 2001. Vol. 97, № 3. – P. 587–600.
6. Locovei S., Bao L., Dahl G. Pannexin 1 in erythrocytes: Function without a gap // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. Vol. 103, № 20. – P. 7655–7659.
7. North R.A. Molecular physiology of P2X receptors // Physiological reviews. – 2002. Vol. 82, № 4. – P. 1013–1067.

Тритерпеновые гликозиды голотурий изучаются на протяжении длительного времени. Установлено, что они обладают широким спектром биологической активности. Для этих соединений отмечены такие свойства, как антимикробная, иммуномодулирующая, иммуноадьювантная и противовоспалительная активности. Кроме того, тритерпеновые гликозиды обладают выраженной мембранолитической активностью, проявляющейся в микромолярном диапазоне концентраций.

Ранее было показано, что тритерпеновый гликозид кукумариозид A2-2, выделенный из дальневосточной голотурии Cucumaria japonica, в наномолярных концентрациях обладает иммуностимулирующим действием, которое выражаются, главным образом, в активации клеточного звена иммунитета: усиливается адгезия, распластывание и подвижность макрофагов, усиливается фагоцитоз и формирование активных форм кислорода, увеличивается скорость пролиферации лимфоцитов, количество антител-образующих клеток селезенки, индуцируется синтез некоторых цитокинов [2, 8].

Однако, несмотря на большое количество работ, связанных с изучением физиологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий, механизм их иммуномодулирующего действия на клеточном и субклеточном уровне изучен недостаточно. Имеющиеся в литературе данные об иммуномодулирующей активности тритерпеновых гликозидов голотурий не дают четкого представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе проявления ими стимулирующего эффекта. Практически полностью отсутствуют сведения о мембранных и внутриклеточных мишенях действия гликозидов и сигнальных путях.

Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия тритерпенового гликозида кукумариозида А2-2, выделенного из голотурии Cucumaria japonica.

В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние кукумариозида А2-2 на транспорт ионов кальция в иммунокомпетентных клетках и фармакологически определить природу рецепторов, ионных каналов и переносчиков, принимающих участие в Са2+ ответе клеток на действие гликозида;

2. Провести иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов, принимающих участие во взаимодействии с кукумариозидом А2-2.

Материалы и методы исследования

Получение клеток. Макрофаги получали из перитонеальной жидкости мышей линии BALB/с (самки весом 20-22 г). В брюшную полость вводили 3 мл ФСБР и интенсивно пальпировали брюшную полость в течение 1–2 мин [1]. Затем с помощью шприца собирали перитонеальную жидкость и переносили ее на покровные стекла в специальные камеры (объемом 200 мкл) для анализа изображения клеток. Камеры инкубировали в термостате при 37 °С в течение 1 часа до полного прикрепления макрофагов ко дну камеры. В дальнейшем клеточный монослой использовали для окрашивания специфическими флуоресцентными зондами и последующего анализа изображения клеток.

Микроцитофлуориметрическая оценка транспорта Са2+. После адгезии и промывки прикрепившиеся макрофаги нагружали зондом Fura-2/AM (10 мкM, Molecular Probes, USA) стекла с клетками монтировали в проточной камере (RC-30HV, Warner Instruments, USA) на предметном столе системы для ратиометрической регистрации флуоресценции клеток (Cairn Research Ltd., UK). Измерение [Са2+]i в клетках осуществлялось инструментальными средствами программы AQM Advance 6 (Kinetic Imaging Ltd., UK).

Иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов. Перитонеальные макрофаги мыши (адгезированные на покровных стеклах или суспензированные в ФСБР) фиксировали путем добавления по каплям холодного 100 %-ного метанола в течение 5 мин при интенсивном встряхивании, трижды промывали ФСБР и блокировали неспецифическое связывание 10 %-ной эмбриональной телячьей сывороткой в ФСБР, содержащей 0,2 % Triton X-100, при комнатной температуре. После промывки в ФСБР клетки инкубировали с первичными антителами в 5 %-ной сыворотке в ФСБР 18 ч при 4 °С, а затем с конъюгированными с флуорохромами вторичными антителами согласно протоколам производителей. Для выявления F4/80 и CD14 маркеров использовали первичные антитела (BioLegend Ltd., США); для выявления пуриновых рецепторов P2X1 (Abcam, Великобритания), P2X4 или P2X7 (Biorbyt Ltd., Великобритания); FITC- или TRITC-конъюгированные вторичные антитела (BioLegend Ltd., США; Abcam, Великобритания). Флуоресцентное изображение монослоя клеток получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 META (Zeiss, Германия). Суспензию перитонеальных макрофагов помещали в проточный цитофлуориметр FACScalibur (Becton-Dickinson, США). Оценку результатов проводили с помощью программного обеспечения LSM510 Release 3.5 (Zeiss, Германия), BD CellQuest Pro (Becton-Dickinson, США) и WinMDI 2.9 (США) соответственно.

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние кукумариозида А2-2 на функционирование пуриновых рецепторов в макрофагах

В настоящее время очевидно, что АТФ (и некоторые другие нуклеотиды) могут выполнять роль нейротрансмиттеров и модуляторов клеточных сигналов во многих типах клеток и периферических тканях. Было установлено, что физиологические эффекты внеклеточной АТФ реализуются посредством специфических рецепторов, получивших название пуринорецепторы. Агонистами этих рецепторов являются не только пуриновые, но и пиримидиновые нуклеотиды. Мембрано-ассоциированные пуриновые рецепторы Р2Х семейства по механизму реализации своего эффекта являются лиганд-оперирующими ионными каналами, регулирующими, главным образом, вход Са2+ в клетки, тогда как P2Y рецепторы имеют G-протеин-опосредованный механизм [4, 7].

В нашей работе изучалась возможность участия пуриновых рецепторов Р2Х семейства в активации транспорта Са2+ и стимуляции перитонеальных мышиных макрофагов кукумариозидом А2-2. В ходе наших исследований было показано, что добавление АТФ к монослою перитонеальных макрофагов в микромолярных концентрациях (10–100 мкМ) вызывает резкое обратимое увеличение концентрации цитоплазматического кальция в клетках (Рис. 1, Б). Было установлено, что наблюдается определенная схожесть в действии на макрофаги кукумариозида А2-2 и АТФ: одинаковая амплитуда и временной диапазон длительности пика (Рис. 1), а также одинаковое количество отвечающих на индукторы клеток, составляющее примерно 20 %–25 % от общего числа регистрируемых клеток.

pis1.tif


Рис. 1. Влияние кукумариозида A2-2 и АТФ на динамику изменения Ca2+ ответа перитонеальных макрофагов мыши, нагруженных зондом Fura-2/AM. Изменение продолжительности (A, Б) и амплитуды (В, Г) Ca2+ ответа клеток (∆F) под воздействием индукторов. Стрелки указывают время введения индукторов. Данные представлены как m ± sd

Хорошо известно, что АТФ вызывает вход Са2+ в цитоплазму перитонеальных макрофагов мыши из внешней среды благодаря избирательному взаимодействию с пуриновыми рецепторами семейства P2X, локализованными в мембранах [9]. Предполагается, что перитонеальные макрофаги мыши содержат ограниченный набор пуриновых рецепторов Р2Х семейства: Р2Х1, Р2Х4 и, возможно, Р2Х7 [9]. Чтобы определить, какие именно P2X рецепторы участвуют в Са2+ ответе макрофагов на действие гликозида, мы использовали ряд относительно селективных блокаторов Р2Х рецепторов: сурамин (Р2Х1); PPADS (Р2Х1); феноловый красный (Р2Х1); фенолфталеин (Р2Х4); бриллиантовый голубой G-250 (Р2Х4, Р2Х7) и KN-62 (Р2Х7) (Sigma-RBI eHandbook).

Результаты экспериментов по регистрации Са2+ ответа макрофагов на добавление кукумариозида А2-2 после предварительного инкубирования клеток с блокаторами представлены на рис. 2, А. Из приведенных результатов видно, что наиболее эффективными являются фенолфталеин (наиболее селективен к Р2Х4 рецепторам) и BBG (наиболее селективен к Р2Х4 и Р2Х7 рецепторам), в микромолярных концентрациях ингибирующих стимулирующее действие кукумариозида А2-2 на 100 % и 50 % соответственно. В то же время, использование блокаторов P2X1 рецепторов, таких как сурамин и PPADS, не приводило к статистически значимому блокированию, а при использовании фенолового красного наблюдалось лишь незначительное (порядка 30 %) ингибирование входа Са2+ в клетки. Применение соединения KN-62, высоко селективного блокатора Р2Х7 рецепторов, также не привело к значимым изменениям в динамике транспорта Са2+.

pis2.tif

Рис. 2. А – влияние блокаторов пуриновых рецепторов и фермента апиразы на вход Са2+ в перитонеальные макрофаги мыши линии Balb/с. Данные представлены как m ± sd. Б – изменения внутриклеточной концентрации Са2+ после применения кукумариозида А2-2 в концентрации 2 мкМ в присутствии фермента апиразы. Сокращения: Sur – сурамин; PhR – феноловый красный; Phph – фенолфталеин; BBG – бриллиантовый голубой G-250; apyrase – апираза

pis3.tif

Рис. 3. Определение геометрических размеров клеток в популяции перитонеальных макрофагов мыши линии BALB/c методами А – проточной цитофлуорометрии и Б – микроскопии. В –локализация пуриновых рецепторов Р2Х типа на поверхности перитонеальных макрофагов методом иммуноцитохимии и последующей конфокальной микроскопии. Определение количества F4/80+ клеток (зрелые макрофаги) в популяции перитонеальных макрофагов мыши Г, Д – методом проточной цитофлуориметрии и Е – конфокальной микроскопии, и колокализация Р2Х4+ / F4/80+ клеток установленная методами Ж – проточной цитофлуориметрии и З – конфокальной микроскопии

 

Фермент апираза (аденозиндифосфатаза) способен расщеплять АТФ путем отщепления остатков фосфорной кислоты и тем самым удалять АТФ из инкубационной среды. В процессе выделения и получения первичной культуры клеток во внешней культуральной среде всегда присутствует незначительное количество АТФ вследствие механического разрушения части клеток при манипуляциях с ними, а также за счет выброса АТФ из клеток по нелитическому механизму (например, через каналы типа Pannexin 1) [6]. Установлено, что культура перитонеальных макрофагов постоянно содержит АТФ во внешней среде в диапазоне концентраций 0,1–10,0 нМ [3]. В наших экспериментах предварительная обработка культуры макрофагов апиразой в концентрации 20 ед/мл в течение 3 ч, приводящая к полному устранению АТФ из инкубационной среды, ингибировала активирующее влияние кукумариозида А2-2 на вход Са2+ в макрофаги практически на 100 % (Рис. 2, А).

Семь пуриновых рецепторов Р2Х семейства (P2X1-P2X7) ранее были обнаружены в теплокровных животных, а мРНК для P2X1, P2X4 и P2X7 рецепторов были идентифицированы в клетках иммунной системы, таких как моноциты, макрофаги и микроглия головного мозга [7]. В перитонеальных макрофагах мыши эти рецепторы воспринимают внешние сигналы, опосредованные внеклеточным АТФ, и принимают участие в модуляции клеточной активности с участием входящих в цитоплазму ионов кальция, высвобождением различных цитокинов, в фагоцитозе, в процессах хемотаксиса и формировании воспаления, а также в инициации апоптоза. В настоящий момент роли пуриновых рецепторов в формировании иммунного ответа клеток в ответ на разнообразные стимулы придается большое значение, а поиски новых агонистов и антагонистов пуриновых рецепторов могут привести к созданию новых препаратов, эффективных в лечении различных заболеваний иммунной системы [5, 10].

В данной серии экспериментов нами было показано, что одними из наиболее вероятных молекулярных мишеней действия кукумариозида А2-2 могут быть пуринергические рецепторы Р2Х семейства (преимущественно Р2Х1 и Р2Х4 типа). Взаимодействие кукумариозида А2-2 с этими рецепторами может приводить к активации входа Са2+ в клетки и временному увеличению [Ca2+]i, а применение определенных селективных блокаторов этих рецепторов ингибирует процесс активации кальциевого транспорта. Полное отсутствие влияния гликозида на вход ионов кальция в культуре макрофагов, предварительно инкубированных с апиразой, свидетельствует о необходимости и важности присутствия АТФ для проявления стимулирующего эффекта кукумариозида А2-2. Это указывает на то, что гликозид не является непосредственным агонистом пуриновых рецепторов макрофагов, но может выступать в качестве аллостерического модулятора, проявляющего свой стимулирующий эффект в присутствии незначительных количеств специфического лиганда – АТФ.

Типирование популяции перитонеальных макрофагов мыши, принимающих участие в Са2+ ответе на кукумариозид А2-2

Обнаружено, что популяция перитонеальных макрофагов мыши не однородна и состоит как минимум из двух субпопуляций клеток, различающихся по размеру и гранулированности (маленькие макрофаги с размером 7,13 ± 0,88 мкм и крупные макрофаги 12,77 ± 2,20 мкм в диаметре) (Рис. 3, А-Б). Только субпопуляция крупных зрелых макрофагов окрашивается антителами к F4/80 (Рис. 3, Е). CD14+ моноциты/макрофаги в культуре не выявлены. На поверхности макрофагов всех субпопуляций выявлены пуриновые рецепторы Р2Х1 и Р2Х4 типа, в то время как рецепторы Р2Х7 типа обнаруживаются в незначительных количествах (Рис. 3, В). Установлено, что плотность пуриновых рецепторов варьирует: выявляются макрофаги (порядка 25–35 %) с повышенной плотностью пуриновых рецепторов, локализованных на F4/80+ макрофагах. Не исключено, что именно такие макрофаги принимают участие в Са2+ -ответе на аппликацию кукумариозида А2-2 (Рис. 3, Ж, З).

Заключение

Таким образом, нами было показано, что кукумариозид А2-2 в субтоксических иммуномодулирующих концентрациях способен активировать резкий и обратимый вход ионов кальция в клетки из внеклеточного пространства. Мембранными мишеней действия гликозида являются пуриновые рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типы), обеспечивающие Са2+-проводимость в мембране макрофагов. Иммуномодулирующее действие кукумариозида А2-2, вероятнее всего, связано с тем, что кукумариозид А2-2 действует в качестве аллостерического модулятора пуриновых рецепторов, связываясь с ними, усиливая ответ клеток на АТФ.

В перитонеальной полости мыши присутствует как минимум две субпопуляции макрофагов, различающиеся размерами, наличием маркеров зрелых макрофагов F4/80 и плотностью пуриновых рецепторов Р2Х1 и Р2Х4 типа. Очевидно, именно крупные F4/80+ / P2X+ положительные перитонеальные макрофаги с повышенной плотностью пуриновых рецепторов принимают участие в Са2+ ответе на аппликацию кукумариозида А2-2.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН д.х.н., в.н.с. Авилову С.А. и к.х.н., н.с. Сильченко А.С. за любезное предоставление кукумариозида А2-2. Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-31435 мол_а. Часть работы, связанной с типированием перитонеальных макрофагов, была выполнена при поддержке гранта РНФ №14-25-00037.


Библиографическая ссылка

Пислягин Е.А., Юрченко Е.А., Горпенченко Т.Ю., Давыдова В.Н., Аминин Д.Л. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРИТЕРПЕНОВОГО ГЛИКОЗИДА КУКУМАРИОЗИДА А2-2 С МЕМБРАННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ МАКРОФАГОВ МЫШИ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2014. – № 12-1. – С. 116-120;
URL: https://www.applied-research.ru/ru/article/view?id=6276 (дата обращения: 14.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074