Введение
Маклюра оранжевая Maclura pomifera (Raf.) Schneid. – дерево семейства тутовых (Moraceae), родина которого - Северная Америка, откуда оно было распространено в другие континенты и страны. Плоды дерева – «Адамово яблоко» используются деятелями народной медицины в качестве сырья для приготовления настойки и мазей широкого лечебного действия, в том числе, судя по публикуемым в интернете рекламным материалам, и канцеролитического. Описанный процесс приготовления настойки из свежих плодов предусматривает их продолжительное (до тринадцати месяцев) настаивание в этиловом спиртe, лечение же настойкой предписывается проводить многомесячным приемом еженедельно увеличиваемых доз (до максимальной в 30 капель) с последующим постепенным снижением дозы до нуля. Исследовательской группой химической лаборатории Университета Огайо (США) в 1937-1946 годы были выделены из плодов Маклюры оранжевой и структурно изучены ее главные активные соединения - два ранее неизвестных пренилизофлавона, названные осаином и помиферином [7]. При исследовании осаина и помиферина в опытах in vivo и in vitro были выявлены антимикробное [4], антиоксидантнoе [6], кардиопротекторное [1], противоопухолевое [3] свойства этих изофлавонов, более выраженные у помиферина [2].
Приведенный краткий перечень биологической активности является, по нашему мнению, веским основанием для осуществления данной работы. Цель работы – определить наличие осаина и помиферина в настойке, рекомендуемой рецептом народной медицины, а также изыскать метод более быстрого приготовления спиртового раствора смеси этих флавоноидов для предложения его к последующему предклиническому изучению в качестве потенциального официнального средства.
Материал и методы исследования
Использованные в качестве сырья желтовато-зеленые, бугристые, шарообразные плоды (массой 250 – 400 г) собраны нами в сентябре 2013 года с деревьев Maclura pomifera, интродуцированных в садах г. Еревана еще в середине прошлого столетия (в частnости, с деревьев нашего Центра и Института ботаники НАН РА). Часть плодов, после измельчения их в свежем состоянии на куски в 2-3 см, использовали для приготовления настойки по рецепту народной медицины (в котором не нормировано количество сырья и спирта): в двухлитровые стеклянные банки с плотно уложенными в них кусочками плодов налили доверху 96% этанол, банки герметично укупорили и хранили в затемненном месте при комнатной температуре (18 –25ºС) в течении года.
Большая часть собранных плодов (15 кг) в разрезанном на 1-2 сантиметровые куски подверглась подсушиванию в тонком слое при 25-30 ºС в затемненном, проветриваемом помещении до постоянной остаточной массы в 20% ± 0,5% от исходной, на что потребовалось 13 суток.
Для выявления осаина и помиферина в растворах использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ) на стеклянных пластинках, покрытых силикагелем КСКГ (Эстония), подвижную фазу – хлороформ : этанол (30:1), проявители : пары йода и 1% раствор хлорного железа в этаноле. Выделение осаина и помиферина из их смеси осуществили методом препаративной ТСХ на пластинках той же марки размером 9,5см × 9,5 см. Идентификацию осаина и помиферина в растворах выявляли по их хроматографической подвижности (Rf), а для выделенных препаративной ТСХ – также по их т.пл., измеренных на микронагревательном столике Boetius PHMK (Dresden), и спектрами 1Н-ЯМР, регистрированными нa приборе Varian Mercury 300 VX в DMSO-d6 (внутренний эталон – ТМС).
Для получения хроматографически чистых осаина, помиферина и их смесей мы использовали в качестве исходного сырья высушенные приведенным выше способом плоды, которые измельчили до частиц размером в 2-3 мм и подвергли экстагированию. Из более чем десяти различных вариантов использованных нами растворителей и схем, мы предлагаем для указанной цели следующий, по нашему мнению, наиболее оптимальный метод: сырье экстрагируют хлороформом в аппарате Сокслета 18-20 часов (до обесцвечивания раствора в патроне с сырьем). Полученный хлороформный экстракт упаривают до сухого остатка, который растворяют при нагревании в пятикратном количестве (мл/г исходного сырья) 50%-ной водно-этанольной смеси. Водно-этанольный раствор охлаждают до комнатной температуры, отфильтровывают, промывают в делительной воронке трижды гексаном (порциями по ¼ от водноэтанольного раствора). Промытый водно-этанольный раствор упаривают при пониженном давлении до сухого остатка, который выдерживают не менее часа при 600С и 3 мм Hg остаточного давления. С выходом 4.0%±0,3% получается желтовато-серый пушистый порошок - смесь осаина и помиферина, обнаруживающую на ТСХ только два пятна с Rf 0,73 и 0,23 (рис.1).
Для достоверной идентификации компонентов смеси было осуществлено ее разделение методом препаративной хроматографии: 100 мг полученного порошка растворили в 2 мл метанола и раствор нанесли с помощью стеклянного капилляра (в виде полос шириной 1,5 – 2.0 мм) на стартовые линии десяти силикагелевых пластинок. После завершения хроматографирования и сушки пластинок в токе теплого воздуха, с пластинок соскребли и собрали отдельно полосы слоев силикагеля (шириной 3-4 мм), соответствующих зонам с Rf 0,73 и 0,23. Силикагелевые порошки одинаковых зон соединили, обработали 20 мл горячего метанола, метанольные растворы фильтровали и упарили досуха. Сухие остатки каждой зоны растворили при нагревании в минимальных количествах (1-1,5мл) 96% этанола. Из охлаженных растворов отделили выпавшие в осадок 30 мг осаина ( т.пл 191-1930С; Rf 0,73) и 33 мг помиферина (т.пл.198-1990С; Rf 0,23).
Ниже приведены фиксированные нами характеристики 1Н-ЯМР спектров осаина и помиферина.
Осаин ,δ,м.д.: 13,17(1Н,с, С5-ОН); 8,95(1Н,с, С4a-ОН); 7,85(1Н,с,С2-Н); 7,27(2Н,д,С2a-Н и С6a-Н); 6,80(2Н,д,С3a-Н и С5a-Н); 6,60(1Н,д,С9-Н); 5,50(1Н,д, С10-Н); 5,16(1Н,тр,С2b-Н); 3,18(2Н,д,С1b-2Н); 1,75(6Н,с,С3b-2СН3); 1,40(6Н,с,С11-2СН3).
Помиферин ,δ,м.д.: 13,191Н,с, С5-ОН); 8,95(1Н,с, С4a-ОН); 8,05(1Н,с,С3a-ОН); 7,85(1Н,с,С2-Н); 6,85(1Н,с,С2a-Н); 6,80 -6,70(2Н, м,С5a-Н и С6a-Н); 6,62(1Н,д,С9-Н); 5,46(1Н,д,С10-Н); 5,15(1Н,тр,С2b-Н); 3,20(2Н,д,С1b-2Н); 1,70 и 1,60(по 3Н,с,С3b-2СН2); 1,4(6Н,с,С11-2СН3). Эти данные хорошо согласуются со структурными особенностями этих изофлавонов (Рис.2), а также с описанными ранее 1Н-ЯМР характеристиками, зафиксированными в дейтероацетоновом растворе [5].
Рис. 1. ТСХ осаина(1), экстракта (2), помиферина (3)
Рис. 2. Структурные формулы осаина (R=H) и помиферина (R=OH)
Изучение спиртовой настойки, полученной по методу народной медицины, проводили нижеследующим способом. Образцы настойки (по 100 мл светлокоричневой жидкости со спиртовым запахом) упаривали втрое при пониженном давлении, остатки экстрагировали хлороформом (50 мл X 3). Хлороформные экстракты, после высушивания безводным сульфатом натрия, упаривали втрое, фильтровали через слой силикагеля SERVA Si60; 0,05-0,1mm (высотой 3 см, диаметром 2 см). Силикагель промывали 20 мл хлороформа и соединенный хлороформный раствор упаривали досуха. Остаток растворяли в 50 мл 50% этанола, прибавляли к раствору 30 мг порошка активированного угля, перемешивали нагревали до кипения, охлаждали, отфильтровывали и фильтрат упаривали досуха. С выходом 120±15 мг получали смесь осаина и помиферина (по ТСХ).
Обсуждение результатов
Изучение хлороформного извлечения из моделей настойки плодов маклюры оранжевой методом ТСХ показало, что оно состоит из смеси осаина и помиферина, содержащей следовые количества примеси липофильных веществ, а также полярных соединений (глюканов). Эти примеси, которые легко удаляются применением адсорбентов (силикагеля и активированного угля), надо полагать, не играют определяющей роли в биологической активности самой настойки. Количество же смеси осаина с помиферином в настойке составляет порядка 0,1%, что в пересчете на максимальную единовременную дозу соответствует около 1 мг. Как было показано в опытах по изысканию рационального способа выделения смеси осаина и помиферина из высушенных плодов, содержание смеси этих изофлавонов составляет около 4%, то есть из 100 г высушенных плодов можно довольно быстро приготовить 4 л раствора с подобным настойке содержанием главных активных компонентов, а также приготовить растворы любой концентрации, необходимой для предклинического исследования
Выводы
Показано, что в настойке плодов маклюры оранжевой, приготавливаемой по рецепту народной медицины, содержание смеси главных активных компонентов – пренилизофлавонов (осаина и помиферина) составляет около 0,1%.
Предложен и апробирован рациональный метод выделения из высушенных плодов маклюры оранжевой очищенной смеси осаина и помиферина, пригодной для приготовления ее спиртового раствора любой концентрации.
Библиографическая ссылка
Ананикян Г.С., Ананикян В.В, Ерибекян М.И, Мнацаканян В.А., Паносян Г.А. ОСАИН И ПОМИФЕРИН - БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА НАСТОЙКИ ПЛОДОВ МАКЛЮРЫ ОРАНЖЕВОЙ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 9-4. – С. 673-675;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=7571 (дата обращения: 19.04.2024).