Как известно, критическим моментом канцерогенеза является приобретение злокачественными клетками способности к инвазии и интравазации, выживание в кровотоке и колонизация микроциркуляторного русла отдаленных органов (этапы метастатического каскада). Однако, способностью метастазировать обладают не все клетки первичной опухоли, а только определенная ее часть (клон), приобретшая в результате накопления мутаций агрессивный фенотип и метастатический потенциал [8]. Одним из факторов, существенно влияющих на вероятность и частоту метастазирования, является уровень циркулирующих в крови опухолевых клеток. Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) происходят из клонов первичной опухоли и представляют собой клетки эпителиального происхождения, которые определяются в периферической крови больных с различными формами солидного рака [6]. Циркулирующие клетки не вступают в клеточный цикл (находятся в фазе покоя – G0), не пролиферируют и потому не подвергаются апоптозу и действию цитотоксических агентов. Они могут циркулировать в виде единичных клеток или объединяться в кровотоке в циркулирующие опухолевые микроэмболы (феномен «коллективной миграции»). Микроэмболы имеют высокий пролиферирующий потенциал, устойчивы к апоптозу и обладают свойствами агрессивного метастазирования. Опухолевые микроэмболы не могут покинуть просвет сосуда экстравазацией, но вызывают опухолевую эмболию, пермеацию в сосуде, разрыв стенки капилляра с последующей пролиферацией в просвете сосуда и интерстиции. Современные технологии позволяют определять и их фенотип, который, как показали исследования, может отличаться от фенотипа клеток первичной опухоли и который необходимо учитывать при планировании схемы и режима противоопухолевой терапии [2]. Изучение ЦОК представляет собой вариант «жидкостной биопсии», позволяющей в ранние сроки предсказывать рецидив рака, прогнозировать течение болезни, осуществлять мониторинг эффективности терапии.
Идентификация циркулирующих опухолевых клеток начиналась с исследований у больных раком молочной и предстательной железы. К настоящему времени циркулирующие опухолевые клетки выявлены при большинстве локализаций злокачественных опухолей и даже введено понятие «высокодиссеминированной ангиогенной болезни». Число ЦОК используют как независимый высокоспецифичный прогностический фактор при раке молочной железы [3], простаты [5] и прямой кишки [4]. Обнаружение ЦОК в крови больных раком молочной железы, предстательной железы и толстой кишки может служить маркером распространенности опухолевого процесса и оценки эффективности проводимого лечения, а также индикатором активности опухолевого процесса и его стабилизации, даже при наличии дистантных метастазов [1].
Изучение циркулирующих опухолевых клеток может внести большой вклад в развитие фундаментальной онкологии и будет способствовать расширению познаний биологии опухолевого роста, которые, несомненно, изменят стандарты диагностики и лечения злокачественных опухолей.
Цель исследования: провести количественную оценку и частоту выявления циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в крови больных раком предстательной железы, молочной железы, толстой кишки, легкого.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлась периферическая кровь 203 больных, из них – 135 больных раком толстой кишки (42–82 года, средний возраст 63,7 ± 1,9 года), III–IV стадии; 38 больных раком молочной железы (31–76 лет, средний возраст 52,6 ± 2,2 года), IIa–III стадии; 20 больных раком лёгкого (50–61 год, средний возраст 52,3 ± 4,8 года), IV стадии; 10 больных раком предстательной железы, III–IV стадии (58–83 года, средний возраст 71,6 ± 3,9 года).
Кровь в объёме 8-10 мл забиралась в пробирки СellSave Preservative Tube, содержащие антикоагулянт ЭДТА, а также реагент для сохранения жизнеспособности опухолевых клеток. Для отделения клеток крови и опухолевых от плазмы кровь смешивалась с рабочим буфером из набора реагентов CellSearch® СТС kit и центрифугировалась при ускорении 800g в течение 10 минут. После этого образцы переносились в аппарат CellTracks® AutoPrep® System, который в автоматическом режиме, удаляя плазму крови и форменные элементы, иммуномагнитно обогащал образец микрочастицами железа, покрытыми антителами к маркёрам адгезии эпителиальных клеток EpCAM, CD45 и цитокератинам 8,18,19. Качество работы системы оценивали с использованием стандартного контроля СТС control kit. Материал сканировался в анализаторе CellTracks® Analyzer II®. С учетом морфологических характеристик и экспрессии маркеров регистрировались циркулирующие опухолевые клетки. Общее число выявленных опухолевых клеток являлось конечным результатом. Референсными значениями считалось менее 5-ти ЦОК в образце при раке груди, менее 3х при колоректальном раке и менее 5-ти при раке простаты.
Результаты исследования и их обсуждение
У больных раком молочной железы IIа-III стадии ЦОК выявлены в 52,6 % случаев (у 20 из 38 больных), при этом единичные опухолевые клетки отмечены в 25 % случаев (у 5 из 20 больных), от 2 до 5 ЦОК в 45 % (у 9 из 20), от 5 до 10 ЦОК в 10 % (у 2 из 20) и свыше 10 клеток выявлено у 4 больных, что составило 20 % от всех выявленных случаев с ЦОК. Из 20 больных, в крови которых выявлены ЦОК, в 15 % (3 больных) определялась IIa стадия заболевания, при этом количество ЦОК в двух случаях составило 1 клетку, в одном – 2 ЦОК. На III стадию заболевания приходилось 85 % случаев с выявленными ЦОК (17 больных). Нами отмечено увеличение вероятности появления ЦОК в крови больных, при наличии метастазов в лимфатических узлах или других органах (в нашем случае, у больной выявлена генерализация процесса с метастазами в кости). Так, у 3 из 15 больных (20 %) при остутствии метастазов в лимфатических узлах или других органах и у 17 из 23 (74 %) при наличии метастазов нами выявлены опухолевые клетки в крови.
У больных колоректальным раком III стадии проведенный анализ выявил в крови наличие клеток опухоли от 1 до 14 ЦОК в 45,5 % случаев (у 20 из 44 больных), из которых только 25 % случаев (5 из 20) превысили референсные значения в 3 клетки в 7,5мл крови. В IV стадии заболевания в 83,5 % случаев обнаружены опухолевые клетки (у 76 из 91 больных), где от 1 до 3 ЦОК выявлено у 45 больных, что составило 59,2 % от общего количества больных с выявленными ЦОК, и свыше 3 клеток – у 31 больных (40,8 %). Среди больных, у которых количество клеток превысило порог позитивности, отмечено, что от 3 до 10 ЦОК выявлено у 19 больных (в 61,3 %), свыше 10 – у 12 больных (38,7 %). Максимальное количество клеток в нашем исследовании – 402 ЦОК выявлено в крови больной раком сигмовидной кишки 63 лет, г/а G3 аденокарцинома с метастазами в печень.
Из 96 больных колоректальным раком III-IV стадии, в крови которых выявлены ЦОК, у 36 выявлена G2 аденокарцинома (37,5 %), у 60 больных – G3 аденокарцинома (62,5 %). Т.е. значительно чаще ЦОК в крови выявлены при низкодифференцированных опухолях. Из 96 больных колоректальным раком III-IV стадии с выявленными в крови ЦОК, у 89 определялись метастазы в лимфатические узлы и печень (в 92,8 % случаев), у 7 –метастазы только в лимфатические узлы (в 7,2 % случаев).
У больных раком предстательной железы с диагностированными метастазами в кости и печень в 70 % случаев были выявлены ЦОК в периферической крови (у 7 из 10 больных). Количество опухолевых клеток у исследуемых больных колебалось в пределах от 1 до 190 клеток в 7,5 мл образца крови. У 6 из 9 исследованных нами образцов крови больных IV стадии заболевания выявлены ЦОК (в 66,7 %), у одного больного III стадии с генерализованным процессом нами также выявлены ЦОК. Из-за преобладания в нашем иследовании больных с IV стадией и небольшом количестве исследований высказаться о достоверных различиях в верояности обнаружения ЦОК при различных стадиях опухолевого процесса не представляется возможным. От 1 до 3 ЦОК нами выявлено у 3 из 7 больных (в 42,9 % случаев с обнаруженными ЦОК). От 3 до 10 ЦОК выявлено у 2 больных (в 28,6 % случаев). Свыше 10 ЦОК также у 2 больных (в 28,6 % случаев). У одного больного с диагностированными метастазами в кости мы обнаружили 37 опухолевых клеток, и у больного с метастазами в печень их количество в исследованном образце крови было максимальным и составило 190 CTCs. В нашем исследовании ЦОК были выявлены у 3 из 5 больных с G2 аденокарциномой (в 60 %), и у 4 из 5 больных с G3 аденокарциномой (в 80 %).
У всех больных с метастазами в печень и больных с метастазами в печень и кости (в нашем исследовании 2 и 1, соответственно) обнаружены циркулирующие опухолевые клетки. Стоит отметить, что максимальное количество клеток среди наших больных было выявлено у больного с диагностированными метастазами в печень. У 4 из 7 больных с метастазами в кости нами выявлены ЦОК (в 57,1 % случаев). У всех больных исследование крови было проведено после или на фоне лучевого или гормонального лечения.
Наибольший интерес для нас, связанный с наличием на ЦОК маркеров EpCAM, цитокератинов 8, 18 и 19, характерных также и для железистого эпителия пищеварительного, респираторного, урогенитального тракта; эндокринных и экзокринных клеток, представляло исследование количества их при опухолях других локализаций. Так, ЦОК были выявлены у 16 из 20 больных раком легкого (80 %) в количестве от 1 до 980 клеток в 7,5 мл крови, при НМРЛ у 10 из 11 (в 91 %), при МРЛ у 6 из 9 человек (в 66,7 %). При МРЛ количество ЦОК находилось в пределах от 1 до 980, тогда как при НМРЛ от 1 до 13 клеток. Доля больных с количеством ЦОК от 1 до 10 клеток составила 50 % (8 из 16 больных), тогда как с уровнем ЦОК от 11 до 100 и свыше 100 клеток, по 25 % (4 из 16 больных). Среди больных МРЛ с выявленными ЦОК преобладали те, у кого количество превышало 100 клеток (в 66,6 % случаев, у 4 из 6 больных), тогда как с наименьшим и средним количеством ЦОК их отмечалось по 16,7 % (по 1 из 6 больных для каждой группы). У больных НМРЛ нами выявлена обратная закономерность. В этой группе у 80 % больных (у 8 из 10) уровень ЦОК соответствовал низким и у 20 % (у 2 из 10) средним значениям. Больные с высокими значениями ЦОК среди НМРЛ отсутствовали. Полученные нами результаты по исследованию количества ЦОК при МРЛ и НМРЛ не противоречат литературным данным, свидетельствующим о снижении частоты обнаружения ЦОК при НМРЛ, чем при МРЛ [7]. Вероятнее всего, последнее связано со снижением плотности молекул адгезии EpCAM на клетках НМРЛ, и как следствие, снижением частоты детекции.
Выводы
Проведенное нами исследование демонстрирует, что частота выявления и количество ЦОК при опухолях различных локализаций широко варьирует.
Полученные нам данные позволили прийти к выводу о различной частоте выявления их при ранних стадиях рака и его генерализованных формах. Так, у больных РМЖ с выявленными ЦОК, вероятность их обнаружения увеличивалась в 5,7 раза при III стадии заболевания, в сравнении с больными IIА стадии; при раке толстой кишки IV стадии частота обнаружения ЦОК в 1,4 раза превосходила данный показатель больных III стадии. Стадия опухолевого процесса с наличием метастазов в лимфатические узлы и отдаленные органы в несколько раз повышает вероятность выявления опухолевых клеток в крови. Так, у больных РМЖ в 3,7 раза чаще выявлялись ЦОК в крови при наличии метастазов в лимфатических узлах или других органах; при раке толстой кишки в 12,9 раза возрастала вероятность обнаружения ЦОК у больных с метастазами в лимфатические узлы и печень, в сравнении с больными, у которых отмечено поражение только лимфатических узлов. В 70 % случаев рака предстательной железы с метастазами в кости и печень выявлены ЦОК в периферической крови.
Отмечена тенденция к повышению частоты обнаружения ЦОК при низкодифференцированных опухолях, где в 1,7 раза чаще ЦОК выявлены при низкодифференцированных опухолях толстой кишки и в 80 % случаев G3 аденокарциномы и в 60 % случаев G2 аденокарциномы предстательной железы.
Проведенное исследование также показало перспективность использованием системы CellSearch для детекции ЦОК с иммунофенотипом CD45-/CK8/18+/CK19+ при эпителиальных опухолях различных локализаций, в частности у больных МР и НМРЛ, демонстрирующее высокую частоту выявления опухолевых клеток у больных генерализованными формами рака легкого. У больных НМРЛ в 1,4 раза чаще выявлялись опухолевые клетки в крови, в сравнении с МРЛ, однако, при НМРЛ преобладающим являлся низкий уровень ЦОК, тогда как при МРЛ – высокий.
Таким образом, определение в крови циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови может быть рекомендовано к использованию в качестве динамичного онкомаркера как для прогноза течения заболевания и тем самым определять «интенсивность» адъювантной терапии, так и для мониторинга больных, получающих системное лечение и оценки его эффективности.
Исследование циркулирующих опухолевых клеток может играть значимую клиническую роль в качестве прогностического онкомаркера нового поколения, влияющего на выбор и контролирующего эффективность противоопухолевого лечения. Возможно, ценность научного и клинического значения циркулирующих опухолевых клеток еще более повысится при изучении их в совокупности с другими прогностическими факторами.
Библиографическая ссылка
Кит О.И., Новикова И.А., Селютина О.Н., Дурицкий М.Н., Донцов В.А., Черникова Е.Н., Саманева Н.Ю., Нистратова О.В. ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ЦОК ПРИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ РАЗЛИЧНЫХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 12-5. – С. 817-820;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=8030 (дата обращения: 18.04.2024).