Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Ключевые позиции здоровья и патологии обусловлены системой адаптивных морфофункциональных и биохимических перестроек в организме [7] и в биомембранах, в частности в ответ на постоянно возникающие во внешней среде изменения [1]. В условиях Севера организм ребенка подвергается воздействию целого ряда экстремальных факторов среды, которые способствуют существенным перестройкам всех его физиологических систем, в том числе и антиоксидантной системы клеточных мембран [4]. Известно, что характерным и неотъемлемым свойством биомембран для суровых условий Севера является повышение липидного обмена, что в свою очередь способствует активации окислительных процессов в них [4]. Важной составляющей антиоксидантной системы клеточного звена организма ребенка является жирорастворимый витамин токоферол. В природе токоферол имеет много форм, но наиболее широко распространенной формой является альфа-токоферол (α-ТКФ), имеющий самую высокую антиоксидантную биологическую активность среди известных молекулярных формул токоферолов [1,8]. При изучении содержания α-ТКФ в крови у жителей Севера, в том числе и у детского населения многие авторы отмечали его пониженный уровень [4,5]. При этом большинством исследователей данный факт оценивался однозначно, как недостаточное содержание данного витамина, требующее дополнительного введения его в организм ребенка [5]. Изученная нами по данному вопросу литература доказывает, что оценка потребности в α-ТКФ только по количественному признаку и по клиническому эффекту не может давать правильного ответа на вопрос о дополнительном введении в организм этого витамина (α-ТКФ). Это происходит в результате мультивалентного характера биохимических преобразований α-ТКФ в биомембранах, что выражается в существовании в естественных условиях «множества» метаболитов данного витамина [1,8], в том числе и прооксидантных. Накопление прооксидантных метаболитов α-ТКФ может происходить в результате нарушения баланса его сопутствующих участников (аскорбиновая кислота, ферментативные антиоксиданты, аминокислоты, микроэлименты и др.) [1,8]. На этом основании мы полагаем, что антиокислительные функции α-ТКФ не всегда связаны с его количественным содержанием в структуре биомембран. Они обусловлены качественными характеристиками, то есть биологической активностью [1]. Эта активность определена существованием в структуре биомембран двух основных форм α-ТКФ, различающихся по биохимическим свойствам и локализации: жирорастворимая, гидрофобная и «водорастворимая» гидрофильная [3,8].

Следует отметить, что наиболее изучено воздействие α-ТКФ на биологическую мембрану, находящегося в жирорастворимой форме. Данная форма витамина в биологически активном состоянии локализуется в области взаимодействия углеводородных «хвостов» легкоокисляемых фосфолипидов, в зоне её двойных связей. В этом случае действие α-ТКФ направлено на восстановление окисленных форм арахидоновой кислоты и сохранение легкоокисляемых фосфолипидов в функционально активном состоянии в структуре биомембран [1,8], что влияет на их текучесть [1].

Менее изучена так называемая гидрофильная форма α-ТКФ, с измененными биохимическими свойствами. В экспериментальной работе, проведенной А.А. Капраловым с соавт (1993) [3] было обнаружено, что многие биомембраны, в том числе и эритроцитарная имеют специфические белки липопротеидной природы, расположенные в их поверхностных областях, в которые поступают жирорастворимые формы α-ТКФ. Группой авторов было доказано, что в результате метаболических преобразований происходит изменение биохимических свойств α-ТКФ. Он становятся «гидрофильным» и, следовательно, менее «опасным», так как накопление окисленных форм в большей степени свойственно жирорастворимому витамину α-ТКФ [6], что способствует снижению его биологической активности вплоть до смены «полярности» воздействия от антиоксидантной к прооксидантной.

Учитывая тот факт, что растущий организм ребенка в условиях Севера испытывает двойную окислительную нагрузку (физиологическую и экологическую), мы полагаем, что на Севере существует система морфофункциональных и биохимических перестроек в организме и в биомембранах, в частности. Они направлены на уменьшение уровня жирорастворимых «опасных» форм витамина α-ТКФ и образование «безопасных» его метаболитов. Для доказательства данной гипотезы необходимо выявление функциональной направленности (антиоксидантной или прооксидантной) альфа-токоферола, что будет возможным при изучении всех известных структурных компонентов биомембран, биохимически и функционально связанных с α-ТКФ (фосфолипиды, интегральные белки и их биофизических характеристик). До настоящего времени α-ТКФ оценивался только по количественному показателю и не изучался во взаимосвязи со структурными фосфолипидами и интегральными белками. Поэтому целью нашей работы явилось изучение взаимодействия α-ТКФ с содержанием основных структурных компонентов эритроцитарных мембран и с их физико-химическими характеристиками.

Материалы и методы исследования

Исследованы практически здоровые дети в возрасте от 8 до 12 лет, проживающие на Севере, в Эвенкии (пос. Тура): дети пришлого населения − 31 человек и коренного населения − 52 человека. Всего исследовано 83 человека.

В мембранах эритроцитов определяли липидный спектр методом тонкослойной хроматографии [9], уровень жирорастворимого витамина альфа-токоферола по методу [10], физико-химические свойства – методом измерения флюоресценции спектров собственной флуоресценции и взаимодействия биомембран с зондами [2]. Данные измерения производились на спектрофлуориметре MPF – 4 марки «Хитачи» (Япония). Исследование физико-химических свойств мембран эритроцитов проводилось по 4 тестам. 1. Определение уровня триптофановых групп белков в липидном слое мембран по калибровочной кривой с использованием стандартного раствора триптофана (длина волны испускания 334 нм и длин волны возбуждения 284 нм) [2]. 2. Оценка текучести жирнокислотных остатков углеводородов мембранных фосфолипидов по эксимеризации пирена (длина волны испускания 350 нм, возбуждения – 340 нм) рассчитывалась по соотношению эксимеры/мономеры [2]. 3. Определение степени подвижности поверхностных белково-липидных структур мембран эритроцитов по характеристики обратной величины анизотропии мембран с встроенным зондом 1-анилино-нафталин-8 сульфонат (АНС) (длина волны испускания 400 нм., возбуждения – 360 нм.) [2]. 4. Определение показателя степени вращательной подвижности молекул триптофанилов ВПМТ мембран эритроцитов по характеристике обратной величины анизотропии триптофановых групп белков биомембран (1/ВПМТ) (длина волны испускания 400 нм., возбуждения – 360 нм) [2].

Применялся коэффициент асимметрии текучестей (КАТ), определяемый по отношению показателя текучестей поверхностных слоев мембран (1/анизотропии зонда АНС) к показателю текучести общего слоя фосфолипидов.

Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистического пакета прикладных программ BIOSTAT, ver. 6.0. (StatSoft Inc. США). Все полученные результаты проверялись на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для количественных признаков использовался непараметрический U-критерий Манн-Уитни при сравнении двух несвязанных выборок. Изменения считаются статистически значимыми при уровне значимости Р< 0,05. Анализ зависимости признаков проводится с помощью расчета и оценки значимости непараметрического коэффициента корреляции по Спирмену. При значении Р< 0,05 регрессионная модель адекватно описывает взаимосвязь признаков. Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде Ме – медиана, (Min-max).

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе уровня жирорастворимого витамина альфа-токоферола в эритроцитарных мембранах (ЭМ) у детей, проживающих в Эвенкии не выявлено статистически значимых различий, связанных с этнической принадлежностью (табл. 1).

Таблица 1

Показатели липидного обмена и жирорастворимого витамина альфа-токоферола в эритроцитарных мембран у детей коренного и пришлого населения Эвенкии от 8 до 12 лет (Me 25 ‰-75 ‰)

Учитывая локализацию и известные функциональные свойства липидрастворимого витамина α-ТКФ, для выявления особенностей его метаболизма у детей Севера мы провели сравнительный анализ липидного и фосфолипидного спектра ЭМ, их физикохимических свойств и выявили следующие этнические различия. У детей пришлого населения по сравнению с детьми эвенков было отмечено статистически значимое снижение общих фосфолипидов (ОФЛ) в структуре ЭМ (р=0,0024; р<0,001) за счет фракции фосфатидилхолина (ФХ) (р=0,0024 ) и его метаболита лизофосфатидилхолина (ЛФХ) (р=0,0010). Немногочисленные изменения в фосфолипидном составе ЭМ имело аналогичные трансформации в показателях физико-химических свойств. Они были выражены в повышении величины показателя вращательной подвижности молекул триптофанилов (ВПМТ) у детей пришлого населения Эвенкии (р=0,0465) и в показателе интегрального коэффициента асимметрии текучестей эритроцитарных мембран (КАТ) (подвижность поверхностного слоя ЭМ/текучесть общего слоя фосфолипидов) (р=0,0173) (табл.2), характеризующий функциональное состояние фосфолипидов.

Таблица 2

Показатели физико-химических свойств эритроцитарных мембран у детей коренного и пришлого населения Эвенкии от 8 до 12 лет (Me 25‰-75‰)

Снижение уровня содержания общих фосфолипидов за счет фракции фосфатидилхолина (ФХ) указывает на менее устойчивую структуру ЭМ у детей пришлого населения Эвенкии. Это, по нашему мнению, свидетельствует о неоднозначных потребностях в антиоксидантах, в том числе и в α-ТКФ. Однако, как было изложено выше, нами не выявлены этнические различия в содержании абсолютного количества этого витамина в их ЭМ. Произведя корреляционный анализе с участием липидрастворимого α-ТКФ и исследуемых показателей нами были получены неоднозначные молекулярные взаимосвязи, доказывающие, что этот витамин у детей коренного и пришлого населения имеет различные метаболические проявления по отношению к мембранным фосфолипидам и интегральным белкам (рис. 1). Так, у детей пришлого населения α-ТКФ в большей степени проявлял свои липидрастворимые качества. Это выражалось в наличии прямых корреляционных взаимосвязей с показателями, отражающими функциональное состояние липидной структуры, причем как гидрофильного ( подвижности поверхностного слоя фосфолипидов в месте его контакта с белком) (r=0,3909, р=0,0030, так и гидрофобного отделов фосфолипидов (текучести) (ТЕК) (r=0,4346, р=0,0146), а так же их соотношения коэффициента асимметрии текучестей (КАТ) (r=0,5293, р=0,0022) (рис.1,а). Наличие прямой корреляционной взаимосвязи данного показателя у детей пришлого населения Эвенкии с интегральным коэффициентом, характеризующим работу фосфолипаз (ЛФХ/ФХ) [1] (r=0,5282, p=0,0022) свидетельствует о том, что при усилении работы данного фермента (повышении величины интегрального коэффициента ЛФХ/ФХ) растет величина другого интегрального коэффициента, КАТ. Это свидетельствует об усилении степени липидного обмена, неотъемлемо связанного с повышением перекисного окисления липидов (ПОЛ). Поэтому повышение данного показателя (КАТ) у детей пришлого населения, являясь адаптивным свойством, при неблагоприятных условиях может быть признаком, отражающим дестабилизационные процессы в эритроцитарных мембранах.

На представленной схеме (рис. 1,а), характеризующией корреляционные взаимосвязи хорошо видно, что α-ТКФ опосредованно через показатель КАТ связан с работой фосфолипаз. В случае повышения в ЭМ липидрастворимого α-ТКФ у детей пришлого населения могут провоцироваться дестабилизационные процессы.

Совершенно иная картина молекулярных взаимодействий наблюдается у детей эвенков. Следует отметить, что в их ЭМ каких либо взаимосвязей α-ТКФ с показателями фосфолипидов, отражающих как их количественное, так и функциональное состояние, не выявлено. По нашему мнению это свидетельствует о метаболических преобразованиях в структуре ЭМ и в самом витамине (α-ТКФ), в результате которых данный витамин, по всей видимости, получил новые качества. На представленной схеме (рис.1,б) отчетливо видно, что модифицированная форма альфа-токоферола имела слабо выраженное прямое влияние на изменение показателя величины (ВПМТ) (r=0,3834, p=0,0060) у детей эвенков. При этом необходимо отметить, что по нашему наблюдению выше названный показатель отражает чувствительность молекул интегральных белков на изменение внешних факторов [5]. Однако другие исследователи, имея дело с патологическими изменениями в клетках крови (лимфацитов) интерпретировали данный факт (повышение подвижности гидрофобной части молекул триптофанилов) как дестабилизационный, характеризующий повышение окислительных процессов [2]. Учитывая выше изложенное сравнительное снижение данного показателя у детей эвенков, по всей видимости, свидетельствует о более устойчивой к внешним факторам садаптированной работе ферментов. Об этом же можно судить по другой корреляции показателя ВПМТ с показателем текучести, отражающим состояние общего билипидного слоя. Обратное направление данного молекулярного взаимодействия (r=−0,4204, p=0,0015) (рис.1,б) подтверждает, что повышение величины показателя ВПМТ может способствовать снижению степени текучести ЭМ, что является неблагоприятным признаком. В то же самое время выше названная взаимосвязь характеризует сравнительное снижение молекулярной подвижности в гидрофобной зоне триптофанилов ЭМ (ВПМТ) у детей эвенков как позитивное. В итоге на представленной схеме (1,б) видно, что наличие прямой корреляционной взаимосвязи α-ТКФ с показателем ВПМТ указывает на то, что повышение модифицированной формы данного витамина (α-ТКФ) в ЭМ может инициировать дестабилизационные изменения. Данный факт также имеет корреляционное подтверждение в виде выявленной прямой взаимосвязи величины показателя ВПМТ с уровнем легкоокисляемых фосфолипидов (ЛОФЛ) (r=0,3049, р=0,0280). Несмотря на отсутствие взаимосвязей с отдельными фракциями ЛОФЛ (ФЭА+ФС+ФИ) и слабую выраженность степени взаимодействия данная корреляция показывает, во-первых, качественные характеристики этих фосфолипидов (накопление окисленных форм), во-вторых, «виновника» в этом. На схеме (рис.1,б) предоставленный факт (изменение качественных характеристик ЛОФЛ) обусловливается, по всей вероятности так же α-ТКФ, но его модифицированная форма оказывает воздействие не на углеводородную гидрофобную зону ЛОФЛ мембран эритроцитов, а на гидрофильную область «головки» фосфолипидов. Подтверждением этому служит выявленная корреляционная взаимосвязь α-ТКФ, с ЛОФЛ через посредничество с показателем величины ВПМТ, которая характеризует степень молекулярной подвижности в гидрофобной зоне интегральных белков ЭМ, в которой находятся гидрофильные «головки» их фосфолипидов, являющиеся активаторами работы ферментов или запускающими при неблагоприятных условиях дестабилизационные процессы [1].

Заключение

Проведенное нами комплексное исследование эритроцитарных мембран (ЭМ) у детей коренного и пришлого населения школьного возраста показало, что α-ТКФ имеет различные метаболические проявления по отношению к фосфолипидам и интегральным белкам у детей коренного и пришлого населения. Это, по всей вероятности, обусловлено специфическими стойкими перестройками гормонально-метаболических параметров организма ребенка, эвенков, отражающими воздействие экстремальных факторов Севера. У детей же пришлого населения мы имеем дело с метаболическими проявлениями α-ТКФ, характерными для средних широт, основное различие которых заключается в участии в ключевых антиокислительных процессах их ЭМ в большей степени жирорастворимой формы α-ТКФ. Этот витамин имеет взаимодействие с углеводородной зоной ЛОФЛ и, следовательно, влияет на их функциональные характеристики в виде подвижности как общего билипидного слоя (гидрофобного) так и поверхностного (гидрофильного). В целом α-ТКФ участвует в регуляции липидного обмена в виде воздействия на работу фосфолипаз, что сопоставимо с литературными данными [1]. Хотя эта взаимосвязь α-ТКФ с показателем, характеризующим работу фосфолипаз (ЛФХ/ФХ) выявлена опосредованно через показатель величины интегрального коэффициента КАТ она имеет одно и тоже прямое направление, которое свидетельствует, что повышение в эритроцитарных мембранах жирорастворимого α-ТКФ при неблагоприятных условиях может вызывать дестабилизационные процессы.

В ЭМ детей коренного населения наблюдается отсутствие молекулярных взаимодействий количественного показателя альфа-токоферола с фосфолипидами, причем, как с их количественным содержанием, так и функциональными характеристиками (физико-химических свойств, характеризующих функциональную активность углеводородной части фосфолипидов). Предоставленный факт свидетельствует о метаболических преобразованиях данного витамина, в результате которых большая часть α-ТКФ получила новые биохимические свойства, изменившие его локализацию в ЭМ. Полученные новые качества позволило модифицированному α-ТКФ в структуре ЭМ у детей эвенков осуществлять более тонкую регуляцию на молекулярном внутри белковом уровне (гидрофобной зоны триптофанилов), что является как первичной реакцией фермента в ответ на воздействие рецепторов, так и пусковым дестабилизационным механизмом в реализации основных эффектов внешнего воздействия.

Таким образом, выявлено, что в экстремальных условиях Севера у детей школьного возраста пришлого населения несбалансированный рост жирорастворимой формы альфа-токоферола в структуре эритроцитарных мембран может спровоцировать дестабилизационные процессы. У детей коренного населения модифицированная форма α-ТКФ также может способствовать дестабилизационным процессам, но они будут менее выражены, что обусловлено неоднозначной биохимической природой α-ТКФ.