Введение
Конечный этап развития эритроидных клеток в костном мозге у млекопитающих происходит в эритробластических островках (ЭО) – клеточных ассоциациях, представляющих собой центрально расположенный макрофаг с «короной» эритроидных клеток разной степени зрелости. Изучение количественного и качественного состава ЭО позволяет изучить особенности взаимодействия между клетками разных гемопоэтических линий, охарактеризовать эффекты цитокинов, гормонов, различных биологически активных веществ и лекарственных препаратов на эритропоэз in vivo и in vitro [2,4,6,8,9]. Морфологический анализ клеток, входящих в состав ЭО, дает возможность рассчитать в единице объема кроветворной ткани количество колониеобразующих единиц эритроцитарных (КОЕэ), вступивших в дифференцировку в костном мозге, определить синхронность волн амплификации при дифференцировке и созревании эритробластов, оценить характер изменения межклеточных взаимодействий в костном мозге при разных состояниях эритропоэза. Так, при экспериментальной полицитемии, при воздействии молекул средней массы, выделенных из крови обожженных животных, при добавлении в культуральную среду тормозящих эритропоэз соединений, при моделировании застойной спленомегалии были выявлены нарушение процесса формирования новых ЭО и замедление созревания эритроидных клеток как в условиях in vitro, так и в костном мозге подопытных животных [1,7]. Воздействие эритропоэтина, катехоламинов или антиоксидантов, напротив, приводило к активации эритропоэза в ЭО, проявляющейся ускорением процесса формирования новых ЭО на основе контактов свободных костномозговых макрофагов с КОЕэ и стимуляцией реконструкции островков, уже имеющих зрелую эритроидную «корону» [2,3,5]. Целью данного исследования явилось определение характера влияния острого γ-облучения на развитие эритроидных клеток в ЭО костного мозга и выявление закономерностей постлучевой регенерации эритроидной ткани, связанных с интенсивностью новообразования ЭО и их поэтапным развитием.
Материалы и методы
Эксперименты были проведены в соответствии c Национальным стандартом Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики", утвержденным и введенным в действие Приказом Ростехрегулирования №544-ст от 02.12.2009. Все манипуляции с животными производили под эфирным наркозом, эвтаназию грызунов осуществляли путем цервикальной дислокации, также проводимой под эфирным наркозом. 20 белых беспородных крыс-самок массой 200-230 г были подвергнуты однократному острому сублетальному γ-облучению, поглощенная доза радиации для каждой крысы составила 6 Гр, эквивалентная доза – 6 Зв. Через 14 суток после облучения животные были выведены из эксперимента с целью оценки состояния эритропоэза. В суспензии костного мозга определяли общее количество ЭО, а после адгезии островков к поверхности чашки Петри – их распределение по классам зрелости согласно классификации Ю.М. Захарова. «Корона» ЭО 1 класса (ЭО1) была представлена проэритробластами и базофильными эритробластами с числом клеток от 2 до 8; «корона» ЭО 2 класса (ЭО2) – базофильными и полихроматофильными эритробластами с числом клеток от 9 до 16; ЭО 3 класса (ЭО3) содержали от 17 до 32 полихроматофильных и оксифильных эритробластов; «корона» инволюцирующих островков (ЭОинв) состояла из полихроматофильных, оксифильных эритробластов и ретикулоцитов с числом ядросодержащих клеток менее 16. Реконструирующиеся островки (ЭОрек) имели в своей «короне» как зрелые клетки (оксифильные эритробласты и ретикулоциты), так и молодые проэритробласты и/или базофильные эритробласты. Для оценки темпа развития ЭО в культуре использовались расчетные показатели: 1. интенсивность вовлечения КОЕэ в дифференцировку (ЭО1 + ЭОрек); 2. общее количество КОЕэ, вступивших в дифференцировку (число ЭО всех классов зрелости + ЭОрек); 3. показатель созревания эритробластов (ЭО3 + ЭОинв / ЭО1 + ЭО2 + ЭОрек); 4. показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз (ЭОрек / ЭОинв). Полученные результаты обрабатывались методами описательной статистики с расчетом средних значений, ошибки среднего, доверительных интервалов, стандартного отклонения. Сравнения групп проводились методами непараметрической статистики с использованием критериев Манна-Уитни и хи-квадрат.
Результаты и обсуждение
Через 14 дней после однократного острого γ-облучения в сублетальной дозе общее количество ЭО в костном мозге крыс было в 2 раза меньше, чем у интактных животных (таблица). При анализе качественного состава ЭО было установлено, что функции центрального звена эритрона у облученных животных к этому сроку поддерживались, в основном, за счет реконструкции: новые островки формировались только при присоединении КОЕэ к макрофагам, уже имеющим зрелую эритроидную «корону» (образование ЭОрек – эритропоэз de repeto). В то же время сам процесс повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз тоже был существенно замедлен, что нашло свое отражение в изменении показателя повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз – после лучевого воздействия он уменьшился в 3 раза.
Эритропоэз в ЭО после острого γ-облучения
|
контроль (n=10) |
опыт (n=10) |
|
|
Общее количество ЭО (103/бедр. кость) |
281,3±5,1 |
149,6±2,2* |
|
% ЭО1 |
5,2±0,01 |
0,2±0,001* |
|
% ЭО2 |
7,4±0,02 |
0,5±0,01* |
|
% ЭО3 |
26,5±0,08 |
13,4±0,05* |
|
% ЭОинв |
50,1±0,1 |
79,2±0,2* |
|
% ЭОрек |
11,3±0,01 |
5,8±0,02* |
|
Общее количество КОЕэ, вступивших в дифференцировку в ЭО (103/бедр. кость) |
310,3±3,4 |
158,5±0,8* |
|
Интенсивность вовлечения КОЕэ в дифференцировку (103/бедр. кость) |
45,7±1,1 |
9,1±0,04* |
|
Показатель созревания эритробластов (усл. ед.) |
3,3±0,01 |
5,3±0,01* |
|
Показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз (усл. ед.) |
0,22±0,001 |
0,07±0,001* |
|
Примечание: * – достоверность различий между опытной и контрольной группами (p<0,05). |
||
ЭО1 и ЭО2 в костном мозге облученных животных практически отсутствовали, что свидетельствует о нарушении механизмов комплексации свободных костномозговых макрофагов с КОЕэ. Общее количество КОЕэ, вступивших в последнюю стадию дифференцировки, в этот момент было в 2 раза меньше, чем в здоровом организме, а интенсивность вовлечения этих эритроидных клеток-предшественниц в эритропоэз в ЭО уменьшилась в 5 раз. В целом, вся совокупность ЭО в костном мозге облученных животных через 2 недели после воздействия более чем на 90% представляла собой ассоциации макрофагов с созревающими и зрелыми эритроидными элементами – оксифильными эритробластами и ретикулоцитами.
При анализе последовательности этапов развития эритроидных клеток ЭО (от ЭО1 до ЭОинв) нами было отмечено явное несоответствие между числом ЭО2 и ЭО3 (ЭО2 составляли только 0,5% от всех островков, а ЭО3 – 13,4%). Это свидетельствует о том, что острое лучевое воздействие привело к нарушению не только пролиферации и дифференцировки эритроидных клеток, но и к замедлению их созревания, что подтверждается изменением показателя созревания эритробластов, который в группе подопытных животных был в 1,6 раза выше, чем в контроле.
Таким образом, угнетение эритроидного ростка кроветворения, возникающее после радиационного воздействия, связано не только с торможением пролиферации ранних клеток-предшественниц в костном мозге [10], но и с нарушением терминальных стадий эритропоэза. Эти нарушения возникают на всех этапах формирования и развития ЭО: при присоединении КОЕэ/проэритробластов к свободным костномозговым макрофагам (эритропоэз de novo), при адгезии КОЕэ/проэритробластов к «короне» зрелых островков, а также при созревании оксифильных эритробластов.