Сперматогенез является индикатором состояния организма. Многоядерные клетки в сперматогенезе у беспозвоночных встречается намного шире, чем нам известно [1, 9] так как отдельно ими не занимаются. Многоядерность описывают как исключительный случай при изучении сперматогенеза [6, 9]. Выявление причины возникновения многоядерности клеток сперматогенного ряда и механизмов её появления очень важно, потому что у некоторых беспозвоночных животных наблюдается несколько типов сперматозоидов, которые отличающихся один от другого. Ранее была отмечена многоядерность сперматогенного эпителия у анадары Броутона [5].
У млекопитающих при нарушении сперматогенеза увеличивается доля аномальных сперматозоидов, что приводит к ограниченной стерильности [2].
Цель настоящего исследования – изучить, встречается ли многоядерность клеток сперматогенного ряда у двустворчатого моллюска мидии Грея (Crenomytilus grayanus), проживающего в чистых акваториях залива Петра Великого Японского моря бухты Лазурная.
Материалы и методы исследования
Изучали состояние семенников двустворчатого моллюска мидии Грея на протяжении года. Кусочки половой железы (гонады) размером 0,5 см фиксировали жидкостью Буэна, спир-уксусной кислотой, спирт-пикриновой кислотой (3:1). По обычной методике заливали в парафин, срезы 5 мкм окрашивали гематоксилином с эозином и железным гематоксилином. Морфометрические исследования проводили на серийных парафиновых срезах семенных фолликулов, просчитывали количество многоядерных сперматогониев на 1000 сперматогониев типа В разной генерации; многоядерных сперматоцитов I и II порядка на 1000 сперматоцитов I и II порядка в фолликулах четырех периодов репродуктивного цикла:
1) размножения, в котором проходит митотическое деление сперматогониев В,
2) роста и созревания, в которых проходит мейоз с образованием сперматоцитов I и II порядков,
3) формирования, в котором идет спермиогенез.
Для распознавания сперматид, предпочтение отдавали реактиву Шиффа по Мак Манусу. Для электронно-микроскопического исследования кусочки семенников фиксировали в 2,5 % растворе глютаральдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере при рh 7,8, содержащем 0,5 % растворе нейтрального формалина, 17 % сахарозы, при температуре 40С в течение двух часов. Дофиксацию проводили 1 % раствором четырехокиси осмия на фосфатном буфере, содержащим 27 % сахарозы, в течение одного часа. После обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации кусочки заливали в эпон 812. Ультратонкие срезы контрастировали 2 % уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали на электронном микроскопе. Полутонкие срезы толщиной 1мкм, окрашенные метиленовым синим, использовали для диагностики клеточных типов сперматогенеза.
Результаты исследования и их обсуждение
Мидия Грея (Crenomytilus grayanus) – двустворчатый моллюск, предпочитает чистые морские акватории без видимых нефтяных загрязнений. Сперматогенез у мидии проходит в фолликулах (пузырьках), которые являются структурной и функциональной единицей половой железы (гонады). Стенка фолликула выстлана вспомогательными клетками. Цитоплазматические выросты вспомогательных клеток образуют компартментализацию сперматогенных клеток разных генераций. Ближе к стенке фолликула располагаются сперматогонии типа А. Это крупные клетки около 8 мкм в диаметре, со светлым ядром и тонким ободком цитоплазмы; в них редко встречаются митозы. Эти клетки находятся в половых фолликулах на всех стадиям полового цикла. Многоядерных клеток среди них не встречается.
Сперматогонии типа В – активно делящиеся митозом клетки. Ядра этих клеток более плотные по сравнению с ядрами сперматогониев типа А и размеры их немного меньше до 7 – 6 мкм. Отростки вспомогательных клеток отделяют сперматогонии типа А от сперматогониев типа В, кроме этого последние располагаются несколько дальше от стенки фолликула к центру, таким образом топографически и морфологически эти два типа сперматогониев хорошо отличаются друг от друга.
Морфометрически многоядерные сперматогонии типа В просчитывали в период размножения, периоды роста и созревания репродуктивного цикла, а в период формирования количество вторичных сперматогониев единично и многоядерность среди них отсутствует (таблица).
В первые три периода около 2 % сперматогониев типа В имеют два ядра, четырех ядерные сперматогонии встречаются единично. В периоды роста и созревания, формирования репродуктивного цикла просчитывали долю многоядерных сперматоцитов. Среди сперматоцитов I и II порядков встречается около 1,5 % многоядерных, чаще двуядерных клеток (таблица).
Многоядерные сперматогонии типа В и сперматоциты I и II порядков по структуре цитоплазмы и ядра не отличаются от одноядерных. Какие либо дегенеративные изменения, такие как: базофилия цитоплазмы, грубая конденсация хроматина, явления кариорексиса, нарушения в строении диктиосом аппарата Гольджи, вздутие крист митохондрий не наблюдались.
В период формирования, на полутонких срезах можно диагностировать двух и четырех ядерные сперматиды, в которых идет спермиогенез. Изучая полутонкие срезы (толщиной 1 мкм) фолликулов перед нерестом, можно видеть, как из единой цитоплазмы дифференцируются самостоятельные два, четыре сперматозоида. Морфологически сперматозоиды, которые образовались из многоядерных сперматид не отличались от сперматозоидов – из одноядерных.
У старых моллюсков мидии Грея иногда наблюдается гермафродитизм, то есть встречаются фолликулы со сперматогенезом или овогенезом в одной гонаде, где преобладает морфология семенников (4). При микроскопическом анализе семенников гермафродитных особей, явно имеющих сбой гормональной регуляции, увеличение многоядерности клеток сперматогенного ряда не отмечалось по отношению к норме.
В гонаде мидии Грея частота встречаемости многоядерных клеток сперматогенного ряда не большая, не более 1,5 – 2 %. Единичные случаи многополюсных митозов, подтверждают, то что в многоядерных сперматогониях типа В не нарушаются дальнейшие периоды митотического цикла и процесс пролиферации идет в той же последовательности, как и у одноядерных половых клеток. Отсутствие восьми и более ядерных сперматид подтверждает возможность нормального цитокинеза у многоядерных сперматогониев и сперматоцитов. Электронно-микроскопические исследования показывают, что одноядерные и многоядерные сперматиды отличаются друг от друга только количеством ядер.
Количество многоядерных сперматогенных клеток в фолликулах гонады мидии Грея разных периодах репродуктивного цикла
|
сперматогенные клетки |
период размножения |
периоды роста и созревания |
период формирования |
|
сперматогонии типа В |
20 ± 0,81 |
19 ± 0,75 |
– |
|
сперматоциты I порядка |
– |
15 ± 0,61 |
14 ± 0,82 |
|
сперматоциты II порядка |
– |
16 ± 0,79 |
15 ± 0,98 |
После нереста в просветах фолликулов семенников появляются амебоциты, в цитоплазме которых видны не выметанные сперматозоиды, такая резорбция в фолликулах после нереста является нормой для двустворчатых моллюсков. Однако при ультраструктурном исследовании мы не встречали в фагосомах амебоцитов многоядерных сперматогониев, сперматоцитов и сперматид.
Исследования по влиянию кадмия и фенола на сперматогенные и вспомогательные клетки морских ежей Strongylocentrotus nudus и Anthocidaris crassispina показали отсутствие многоядерности сперматогенных клеток в контроле, то есть в норме, однако в гонаде ежей, подвергнутых действию фенола, отмечаются четырех ядерные сперматиды и двуядерные сперматозоиды, нарушение крист митоходрий сперматогониев и сперматоцитов [6]. Ультраструктурные исследования амебоцитов и их функция в семенниках морских ежей под действием токсикантов окружающей среды, показали усиление активности аппарата Гольджи и исчезновение зародышевой плазмы в сперматогония [7, 8].
Отсутствие конгломератов половых клеток, которые встречаются у мии японской (двустворчатого моллюска) [4], морфологически нормальные сперматозоиды мидии, образующиеся из двух или четырех ядерных сперматид, отсутствие дегенерации многоядерных сперматогенных элементов, доказывают, что механизм повреждения цитокинеза, не передается дочерниям клеткам сперматогенного ряда самцов мидия Грея.