Антоцианы – древние пигменты растений флавоноидной природы, придающие различным частям растений окраску синих, фиолетовых, красных цветов. В Петергофской генетической коллекции ржи сохранены линии с разнообразной окраской тканей и органов, обусловленной разным качественным и количественным составом антоцианов. Основными функциями антоцианов в растениях являются привлечение животных – опылителей и распространителей семян и защита клеток от избыточного солнечного света и повреждения ультрафиолетом [1]. Поскольку рожь опыляется ветром, а семена рассеиваются преимущественно без участия животных, то функция защиты от УФ-излучения является в данном случае для антоцианов ржи основной. Рожь (Secale cereale L.) – хлебная злаковая культура, которую человек культивирует со времён неолита. Рожь ценна своим зерном для питания человека, как сырье для производства спирта и крахмала, зелёные части растения идут на корм скоту и в качестве сидерата. В последние несколько лет опубликовано значительное количество статей, посвящённых положительному влиянию на здоровье человека от употребления ржаных продуктов. Положительные эффекты отмечены для больных диабетом 2-го типа, инфарктом миокарда [2], помимо этого, рожь даже поддерживает целостность нейронов [3]. Кроме того, в отличие от более широко возделываемого злака – пшеницы, рожь в значительной степени сохранила природное разнообразие, в том числе и по окраске семян. Окраска семян у ржи в основном зависит от наличия антоцианов, являющихся антиоксидантами. Ряд статей и обзоров подтверждают положительное влияние на здоровье человека потребляемых с пищей антоцианов [4]. На основании литературных данных можно заключить, что зёрна ржи, особенно с антоциановой окраской, являются ценным пищевым продуктом, на основе которого производится так называемая «здоровая» еда (functional food). В этой связи изучение биосинтеза антоцианов у линий ржи с различным типом окраски для определения конкретных генов представляется актуальным.

Путь биосинтеза антоцианов в растениях изучен довольно полно, в частности его изучали у ячменя, риса, кукурузы. Необходимым для синтеза окрашенных антоцианов из неокрашенных предшественников является фермент антоцианидинсинтаза, за синтез которого ответственен ген ANS. В Петергофской генетической коллекции ржи идентифицированы безантоциановые линии, несущие рецессивные мутации в пяти неаллельных генах (vi1, vi2, vi3, vi4, vi5, vi6) и не имеющие антоциановой окраски зерна и вегетативных органов. Мы предположили, что, по крайней мере, у части безантоциановых линий изменения могут быть связаны с мутациями именно в гене ANS. Для проверки этой гипотезы авторами был секвенирован и проанализирован функционально значимый участок гена ANS у шести безантоциановых линий и трех высокоинбредных линий с наличием антоциановой окраски.

Материалы и методы исследования

В работе использованы 6 линий ржи (vi1, vi2, vi3, vi4, vi5, vi6), характеризующиеся отсутствием антоциановой окраски на вегетативных частях растения и в зерне. Линии содержат мутации в пяти неаллельных генах (vi1, vi2, vi3, vi4 = vi5, vi6). В качестве контрольных были использованы высокоинбредные линии 2, 7 и 87. Линии 2 и 7 характеризуются жёлтой (безантоциановой) окраской зерновок и наличием антоциановой окраски на вегетативных частях растений, у линии 87 зелёная окраска зерновок (содержится антоциан дельфинидин рутинозид) и наличие антоциановой окраски на вегетативных частях растений. Для выделения ДНК семена проращивали на чашках в нестерильных условиях. ДНК выделяли из 5–7-дневных проростков с использованием буфера на основе цетиламмоний бромида по протоколу [5]. Качество ДНК оценивали на 1 % агарозном геле. Амплификацию фрагмента гена ANS проводили с использованием праймеров

Ans_F_new GGGAAGAGGGAGTGGGAGGACTACCTGT, Ans_R_new GCGAAGACGACCCAGGAGACGCGCACGG (ООО «Бигль», РФ). Последовательность участка данного гена взята из базы данных NCBI (Sequence ID NCBI: EU815626.1) [6] с уточнениями на основании собственных результатов секвенирования. Амплификацию продукта размером 542 п.н. проводили при температуре отжига 60 °С в амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», РФ). Секвенирование ПЦР-продуктов проводили на генетическом анализаторе ABI Prism 3500xl (Applied Biosystems, USA).

Анализ сиквенсов проводили с помощью программы Chromas [7], поиск сходных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили в базе NCBI с помощью алгоритма BLAST [8], поиск контигов ржи [9], трансляцию нуклеотидных последовательностей и поиск белковых доменов [10], множественное выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей [11].

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ нуклеотидных последовательностей участка гена ANS

Одним из существенных ферментов биосинтеза антоцианов является антоцианидинсинтаза. Для ржи в базе данных по нуклеотидным последовательностям NCBI содержится лишь небольшой (542 п.н.) фрагмент соответствующего гена ANS (Sequence ID: EU815626.1) [6], для других видов, в частности пшеницы, известны полные сиквенсы генов ANS. На основе выравнивания нуклеотидных последовательностей генов ANS пшеницы нами были подобраны праймеры для амплификации фрагмента длиной 580 п.н., отличного от имеющегося в GenBank. Амплификаты, наработанные на ДНК безантоциановых растений линий vi1…vi6 и контрольных линий 2, 7 и 87, были отсеквенированы. Анализ полученных сиквенсов выявил различия в последовательностях, связанных с однонуклеотидными заменами и делециями/инсерциями нуклеотидов длиной 6 и 9 нуклеотидов. Причём эти различия были выявлены не только между безантоциановыми линиями и контрольными линиями, но и среди контрольных линий.

Так, у линий 2 и 87 присутствует делеция в 9 нуклеотидов, которой нет у всех остальных линий; у всех линий кроме линии vi3 присутствует делеция в 6 нуклеотидов (рис. 1). Таким образом, на уровне анализа нуклеотидных последовательностей нам не удалось выявить различия, которые бы маркировали признак «наличие антоциановой окраски». Поскольку длина выявленных делеций кратна 3 (размеру кодона), то следующим нашим шагом стала трансляция нуклеотидных последовательностей и анализ соответствующих аминокислотных последовательностей.

Анализ аминокислотных последовательностей участка гена ANS

Для установления рамки считывания отсеквенированные последовательности сравнивали с генами антоцианидинсинтазы пшеницы (Sequence ID NCBI: AB247917.1, AB247919.1, AB247920.1). Трансляция и анализ аминокислотной последовательности линии vi2 позволил обнаружить преждевременный стоп-кодон в рамке считывания. Данный факт позволяет предположить, что отсутствие антоцианов в линии vi2 действительно связано с мутацией в гене антоцианидинсинтазы.

Поскольку нас очень заинтересовал факт обнаружения в сиквенсах линий довольно необычных делеций кратных трём, мы решили выяснить, является ли такая вариабельность «нормальной» для гена антоцианидинсинтазы и могут ли быть связаны делеции с нарушениями в функциональных доменах белка.

Для оценки вариабельности гена антоцианидинсинтазы мы проанализировали нуклеотидные последовательности этого гена у близкого родственника ржи, пшеницы Triticum aestivum L. У пшеницы охарактеризованы 5 генов антоцианидинсинтазы (Sequence ID NCBI: AB247917.1, AB247919.1, AB247920.1, AB247921.1, AB247918.1). Выравнивание нуклеотидных последовательностей выявило несколько делеций/инсерций, но в области исследуемого участка (154–306 а.к.) мы обнаружили только одну 6-нуклеотидную делецию, присутствующую у генов TaANS-A2, TaANS-B1, TaANS-B2, TaANS-D1 и отсутствующую у гена TaANS-A1. Таким образом, вариабельность участка гена антоцианидинсинтаза у ржи значительно выше, чем у пшеницы, что согласуется с данными о том, что в отличие от более широко возделываемого злака – пшеницы, рожь в значительной степени сохранила природное разнообразие не только на фенотипическом, но и на генотипическом уровне [12].

Структура белка антоцианидинсинтаза хорошо изучена на арабидопсисе [13]. Мы сравнили аминокислотные последовательности арабидопсиса и фрагментов гена антоцианидинсинтазы исследуемых линий ржи. Несмотря на довольно длительную (около 100 млн лет) независимую эволюцию однодольных и двудольных растений, аминокислотные последовательности оказались с довольно значительной степенью сходства (49 % по данным выравнивания). Сопоставив выявленные у белка арабидопсиса участки, формирующие вторичные структуры (α-спирали и β-слои), а также, функционально значимые аминокислоты, участвующие в присоединении ионов железа, являющихся кофакторами, с последовательностью ржи (рис. 2), можно заметить, что в основном, делеции находятся в промежутках между функционально значимыми участками и не затрагивают их.

Исключение составляют 9-нуклеотидные делеции, затрагивающие участок β-слоя, у линий 2 и 87. Интересным фактом является и однонуклеотидная замена, приводящая к замене у тех же линий аспарагиновой кислоты (D) на аспарагин (N) в положении 234 (по последовательности арабидопсиса). Эта замена, по-видимому, является существенной, поскольку аспарагиновая кислота участвует в присоединении ионов железа, необходимых для каталитической функции антоцианидинсинтазы. В этом положении у всех остальных проанализированных последовательностей ржи, арабидопсиса и пшеницы находится именно аспарагиновая кислота. Аспарагиновая кислота и аспарагин довольно сильно отличаются по физико-химическим свойствам, а значит, эта замена должна значительно отразиться на каталитических свойствах фермента и фенотипе растений. Однако линии 2 и 87 проявляют антоциановую окраску на вегетативных частях растений и на зерновках (линия 87). Можно предположить, что у ржи, как и у других злаковых, в геноме присутствует не одна копия гена антоцианидинсинтаза, а несколько. При функциональном повреждении одной копии не происходит блокирование синтеза антоцианов на всём растении, а лишь на некоторых частях. Это предположение подтверждается данными по секвенированию генома ржи в 2017 г. [14]. В базе данных нуклеотидных последовательностей ржи [9] нам удалось обнаружить три последовательности, отнесённые авторами к гену антоцианидинсинтазы на основе сходства с пшеницей T. urartum и Aegilops tauschii. Одну из этих последовательностей отнесли к хромосоме 4. К сожалению, сиквенсы последовательностей, представленные в базе данных, довольно короткие и их сравнительный анализ не позволяет надёжно подтвердить версию о нескольких копиях антоцианидинсинтазы в геноме ржи.

Заключение

Проанализировав нуклеотидные и аминокислотные последовательности участка гена антоцианидинсинтазы ржи, соответствующего домену FE2OG_OXY (оксиглутарат/железозависимая диоксигеназа), мы пришли к следующим заключениям:

1) преждевременный стоп-кодон у линии vi2 позволяет предполагать, что основа безантоциановости связана с мутацией в гене антоцианидинсинтазы;

2) выявлена значительная вариабельность структуры последовательности домена FE2OG_OXY у ржи по сравнению с пшеницей. Межлинейные различия включают в себя однонуклеотидные замены и делеции/инсерции длиной 6 и 9 нуклеотидов;

3) различия в последовательностях домена FE2OG_OXY у линий ржи в большинстве случаев не затрагивают функционально значимые участки;

4) исключением являются делеция в 6 нуклеотидов и несинонимичная замена в пределах функционально значимых участков у линий 2 и 87 с антоциановой окраской вегетативных частей растений. Поскольку значимые замены не привели к отсутствию антоцианов у этих линий, можно предположить, что в геноме ржи присутствует несколько копий генов антоцианидинсинтазы, что подтверждается результатами геномного секвенирования.

Дальнейшие исследования молекулярных основ проявления безантоциановости будут связаны с секвенированием и анализом полноразмерных копий гена ANS у линий ржи, прежде всего у линии vi2.

Данная работа была выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-04-00411 и в рамках темы «Генетика и селекция ржи на основе наследственного природного разнообразия». Часть работы проведена в Ресурсном центре «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.