Всестороннее изучение дикорастущей флоры вызвано наличием ряда существенных проблем как в области сохранения биоразнообразия видов, так и в области фитохимических, фармакологических и биотехнологических исследований [1, 2]. Большое внимание уделяется изучению роли копеечников [3–5], в том числе и в традиционной медицине [6] Монголии, Китая, решаются проблемы таксономии [7] и биохимии рода [8–10]. За последние десятилетия при помощи различных методов хроматографии из растений рода Hedysarum стали известны 155 соединений, которые показали предполагаемую активность: антиоксидантную, активность против старения, регулирование активности иммунной системы, противоопухолевую активность [11].

Значительный интерес с этой точки зрения представляет род Hedysarum флоры Кыргызстана – один из многочисленных родов, включает 34 вида [12], что составляет 17 % мирового видового разнообразия, среди которых высок процент эндемиков. Особенности климатических и экологических условий в Республике, разнообразие географических зон способствуют биосинтезу и накоплению в растениях физиологически активных соединений. Их видовой состав, ареал, биоморфологические характеристики впервые были представлены в монографии Султановой [13].

При поддержке Королевского ботанического сада, Кью нами созданы при Институте биотехнологии НАН КР семенной банк [14, 15], коллекции культуры тканей и изолированных органов растений дикорастущей флоры, где хранятся коллекции рода Hedysarum (www.plant-biotech.kg).

Целью данного исследования было провести скрининг на содержание флавоноидов и АОА в нативных растениях и культурах in vitro – hairy roots.

Материалы и методы исследования

Было исследовано 17 видов растений рода Hedysarum из коллекции семенного банка, половина видов имеет статус эндемиков. Два вида – H. chaitocarpum и H. montanum – были продублированы в сравнительном изучении и взяты из двух разных географических зон. Местонахождение и природоохранный статус испытуемых растений приведены в табл. 1. Использовались гербарный материал, а также культуры тканей in vitro – hairy roots для определения количественного содержания флавоноидов для каждого вида и распределения их по частям растения, а также расчета АОА.

В образцах определяли сумму флавоноидов и антиоксидантную активность (АОА). Для расчета суммарного содержания флавоноидов использовали экспресс-методику [16, 17]. АОА определяли двумя методами – в соответствии с описанием патентного изобретения Т.В. Максимовой и иных [18] и с использованием DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом).

На хроматографе Agilent 1260 Infinity методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определяли содержание изофлавона (формононетина) в экстрактах растений. Для анализа использовались нативные корни и hairy roots 4 видов растений рода Hedysarum из коллекции трансформированных корней копеечников, которые ранее были получены лабораторией Института биотехнологии растений НАН КР. Калибровку хроматографа проводили по стандарту формононетину с использованием колонки Eclipse Plus C18, 5 µm, 4,5 х 250 мм.

Результаты исследования и их обсуждение

Большее накопление флавоноидов отмечали в листьях по сравнению с другими частями растений, исключением был вид H. flavescens, у которого в цветках содержание флавоноидов превышало их содержание в листьях, данные представлены в табл. 1. Из 17 испытуемых видов наибольший эффект отмечен у H. neglectum, H. flavescens и H. kirghisorum. При сопоставлении одних и тех же видов, произрастающих в разных географических зонах (H. chaitocarpum и H. montanum), было отмечено, что количество флавоноидов существенно различалось. Это соответствует данным о том, что различия в химическом составе могут иметь место в пределах одного и того же вида в зависимости от географического происхождения [19].

Результаты определения АОА двумя методами представлены в табл. 1 и на рис. 1. Следует отметить, что наблюдалась определенная корреляция между данными, полученными в обоих экспериментах. Наивысшие показатели АОА были выявлены у H. flavescens, как в цветках, так и в листьях. Высокая АОА в цветках была отмечена у H. dmitrievae.

Определенный интерес представляют изучение компонентов флавоноидной природы не только в нативных растениях, но и в тканях растений Hedysarum и проведение сравнительного анализа гербарного материала и культур тканей. В работе были использованы культуры hairy roots из коллекции банка семян Института биотехнологии [20].

Ранее нами совместно с И.Н. Кузовкиной (ИФР РАН) был проведен анализ корней эндемика H. enaffae (hairy root and isolated root) на базе Института фармакогнозии Университета им. Семмельвайса (Будапешт, Венгрия) [21]. Результаты ВЭЖХ анализа корней H. enaffae показали, что доминирующим компонентом культивируемых in vitro корней hairy roots являются изофлавоны – производные формононетина. Обнаруженные четко выраженные пики веществ соответствуют двум изофлавонам, которые были идентифицированы на основании данных ВЭЖХ и UV-спектроскопии и подтверждены данными 1H- и 13С ЯМР-спектрометрии, проведенной в Институте химической экологии им. Макса Планка в Йене (Германия). Результаты хроматографии показали, что доминирующим флавоноидом hairy roots and isolated roots копеечника является изофлавон ононин.

Изофлавон ононин является гликозидом агликона формононетина, который в свободном виде не обнаружен в корневых культурах H. enaffae (в отличие от hairy roots of H. theinum). Поскольку основным компонентом культивируемых корней H. enaffae является ононин, было определено количественное содержание этого изофлавона в hairy roots. На основании данных ВЭЖХ по площади пиков была вычислена концентрация ононина в этих двух культурах. Результаты показали, что концентрация ононина в hairy roots составляет 10,91 мг/г сухого веса корней (или 1,1 %), в то время как в изолированных корнях концентрация изофлавона – 0,945 мг/г сухого веса (или 0,095 %), т.е. на один порядок ниже.

Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Содержание формононетина в нативных (NR) и трансформированных корнях (HR) растений рода Hedysarum, мг/г сухого вещества

Содержание формононетина в hairy roots превышало его содержание в нативных растениях более чем в 4 раза у H. denticulatum, более чем в 7 раз у H. parvum, более чем в 22 раза у H. santalaschii, а в нативных корнях H. daraut-kurganicum обнаруживаются следы формононетина.

Рис. 2. Хроматограмма нативных (А) и hairy roots H. denticulatum (Б) по определению формононетина

Выводы

Исследованы 17 видов рода Hedysarum флоры Кыргызстана, большинство из которых имеют природоохранный статус «эндемики» и «субэндемики». В нативных растениях выявлено высокое содержание флавоноидов и АОА у H. neglectum, H. kirghisorum и H. flavescens. Сравнительное изучение содержания формононетина в нативных растениях и в hairy roots показало превышение его концентрации в несколько раз в hairy roots по сравнению с нативными растениями, что говорит о преимуществе использования методов биотехнологии.