Lumbricus terrestris и E. fetida могут легко выжить при концентрации 0,5 % (5000 мг/ кг-1) сырой нефти в почве в течение 15 дней (Safawat и Уивер,2002). В почве, загрязненной 1.5 % (15 000 мг/кг) сырой нефти, выживаемость E. fetida была снижена на 40 %, в то время как L. terrestris выжили в течение более чем 15 дней. В противоположность, другие авторы сообщали, что концентрация 9500 УВ мг/кг сырой нефти, была причиной высокой смертности в E. fetida, А. chlorotica и L. terrestris в почве без навоза КРС (на 0,6 %), как корма после 28 дней культивирования (Шефер и Filser,2007). Однако, черви не выжили при концентрации керосина 2000 мг /кг ^-1,30,000 мг кг дизельного топлива 30,000 мг /кг в течение 14 дней.

Витфилд Аслунд с соавт. отмечают отсутствие острой токсичности нефтезагрязнённых почв для червей E. fetida и 90 % выживаемость при низких концентрациях нефти, но нарушение их репродуктивной функции. Дорн с соавторами (2007) отметили высокую чувствительность E. Fetida к загрязнению почвы нефтью. Навозный червь выживает в течение 90 дней в почве загрязненной низкими концентрациями нефти.

Eom, I.C. с соавт.(2007) изучали выживаемость навозного червя при внесении в почву нефти в концентрации 2600-2800 мг/кг в течение 28 дней.Дождевые черви могут быть использованы в биоремедиации нефтезагрязненных почв при умеренной концентрации УВ (<4000 мг/кг), не смертельной для червей. Дождевые черви могут быть применены на более поздних стадиях биоремедиации даже очень загрязненных участков, при низкой концентрации УВ и снизить содержание УВ до допустимого уровня. В результате возникает вопрос при какой концентрации нефтепродуктов навозные черви сохраняют способность к биоремедиации и как можно повысить выживаемость E.Fetida при внесении значительных концентраций нефти.

Цель исследования: оценка способности дождевых червей к ремедиации почв, загрязненных отработанным машинным маслом.

Нашей задачей является установление максимальной концентрации масел в почве, при которой сохраняется жизнедеятельность дождевых червей и сроки полной очистки почвы от нефтепродуктов.

Материалы и методы исследования

Тест-субстрат

Тест субстратом для трех экспериментов была луговая почва стерильна для лабораторных испытаний «Питательный грунт Живая Земля (Terra Vita) Универсальный» Содержание гумуса 46 %, pH 5,9-6,0 и емкость поглощения 28 -40 мг-экв на 100 г почвы; азот (NH₄ + NO₃) – 150 мг/л, фосфор (P₂O₅) – 270 мг/ л, калий (K₂O) – 300 мг/л. Почва была загрязнена в эксперименте отработанным машинным маслом (начальные концентрации: 20 г/кг , конечные – 100 г/кг).

Вид дождевых червей

Навозный червь Eisenia fetida

Дождевой червь (навозный, компостный, земляной) является одним из восьми родов семейства люмбрицид и относится к классу кольчатых малощетинковых червей. Обитает во всех видах почв, чаще всего в навозе, парниках, на свалках. Распространение всесветное [Перель Т.С.,1975]. Длина тела 40-130 мм, ширина 2-4 мм. Число сегментов 80-120. Окраска тела красновато-фиолетовая, причем пигментация может быть очень яркой: красной различных оттенков, бурой, фиолетовой, оранжево-розовой. Характерная черта – наличие на теле поперечных полос желтого цвета, особенно заметных, когда червь растягивается. Головная лопасть эпилобическая.

Микробиологический препарат

В качестве источника молочнокислых, азотофиксирующих и фотосинтезирующих бактерий использовали биопрепарат «Байкал – Эм» (Изготовлен ООО «НПО ЭМ-Центр», Россия» ( Номер государственной регистрации 226-19,156-1) в количестве 5 мл на 1 кг субстрата при уровне загрязнения нефтепродуктами выше 50 г/кг почвы. Биопрепарат содержит большое количество анабиотических микроорганизмов, обитающих в почве: молочнокислые, азотфиксирующие, нитрифицирующие бактерии, актиномицеты, дрожжи и ферментирующие грибы.

Методики анализа содержания в почве нефтепродуктов и органических веществ

Подготовка образцов почвы

В полипропиленовые емкости, объемом 2 литра, на дно укладывали дренаж. В качестве дренажа использовался керамзит с диаметром частиц 2 см., на дренаж насыпали слой почвы толщиной 15 см (1 кг). В каждую емкость вносили по 10 половозрелых червей. На протяжении всего эксперимента почву увлажняли один раз в неделю, добавляя в каждую емкость по 100 мл дистиллированной воды. На протяжении всего эксперимента еженедельно в каждой емкости фиксировали изменение состояния и количество червей. При этом учитывались следующие показатели: общее количество всех червей, количество половозрелых особей, количество неполовозрелых особей, количество коконов в емкости, количество коконов на одного половозрелого червя, выход ювенильных особей червей из одного кокона, отношение количества половозрелых и неполовозрелых особей в каждой емкости и распределение червей по высоте слоя земляного субстрата.

Отбор проб из образцов почвы, загрязненных нефтью для анализа содержания нефти и органических веществ в образцах проводили по ГОСТ 28168, ГОСТ 17.4.3.01 и ГОСТ 17.4.4.02. Почву размалывали в ступке. Из размолотой почвы отбирали пробу массой 3 – 5 г и дополнительно измельчали до размера частиц менее 0,3 мм и просеивали через сито с размерами ячеек 0.25 мм.

Определение содержания нефтепродуктов в загрязненных почвах

Для определения содержания автомобильного масла или нефтепродуктов в почве была использована методика, предложенная институтом экспериментальной метрологии [МУК 4.1.1956-05]. Данная методика основана на определении количества углеводородов, экстрагированных четыреххлористым углеродом из нефтезагрязненной почвы. Полученные результаты были обработаны с использованием рангового метода Фридмана c использованием лицензионной программы «Статистика»

Протоколы испытаний

Исследования проводились в течение 4 месяцев. В полипропиленовые сосуды, объемом 2 литра, на дно укладывали дренаж. Затем засыпали слой почвы толщиной 15 см (1 кг). В каждый вариант вносили по 10 половозрелых червей в каждый сосуд и поливали дистиллированной водой 1 раз в неделю по 100 мл. Червей подкармливали свежим тертым картофелем 1 раз в неделю по 5 гр. и увлажняли почву 2 раза в неделю по 100 мл дистиллированной воды. Разбор червей проводили через 14 дней вручную послойно. Червей инкубировали при температуре +15 °С в течение 4 месяцев. Процесс контролировали по следующим показателям: численность общая, численность половозрелых особей, Полученные результаты были обработаны с использованием рангового метода Фридмана. Протоколы испытаний представлены в таблице.

Результаты исследования и их обсуждение

При внесении концентраций масла от 20 до 100 г/кг отмечалась 93–100 % выживаемость E. fetida и стабильный рост численности червей, но внесение микробиологического препарата при высоких концентрациях масла более 50 г/кг снизило выживаемость до 43-63 %. В контрольном варианте и при внесении микробиологического препарата выживаемость дождевых червей была 100 %.

Общая численность E. fetida. В варианте с концентрацией масла 20-40 г/кг как с микробиологическим препаратом, так и без него, общая численность увеличилась в 3 раза. При внесении в почву 60 г/кг масла общая численность увеличилась в 3 раза, а внесение микробиологического препарата вызвало гибель 50 % половозрелых особей и численность достигла 10 экз./сосуд. В вариантах с внесением масла 80-100 г/кг общая численность составила 10-14 экз./сосуд, а при внесении микробиологического препарата снизилась до 8-9 экз./сосуд. Вероятно, микроорганизмы облегчали проникновение масла через пищеварительный тракт и усиливали токсический эффект. В контрольном варианте общая численность составила 76 экз./сосуд, а при внесении микробиологического препарата 203 экз./сосуд.

Таблица 1

Выживаемость, общая численность, общая продуктивность и индивидуальная продуктивность дождевых червей при различных концентрациях отработанного масла в почве. Протоколы испытаний

Общая продуктивность E. fetida. Максимальная общая продуктивность отмечена в контрольном варианте и при внесении микробиологического препарата. Высокая индивидуальная продуктивность (10 коконов/сосуд) отмечалась при внесении низких концентраций масла 20-40 г/кг, но внесение микробиологического препарата снизило откладку коконов в 2 раза. Увеличение концентрации масло вызвало снижение откладки коконов, а внесение микробиологического препарата усугубляло токсический эффект масла.

Индивидуальная продуктивность E. fetida. Высокая индивидуальная продуктивность 0,9 –1,0 коконов на червя отмечены в контрольном варианте, при внесении микробиологического препарата и при внесении низких концентраций масла 20-40 г/кг. Увеличение концентрации масла от 60 до 100 г/кг. Снизило откладку коконов до 0,24-0,46 коконов на червя, причем внесение микробиологического препарата незначительно увеличивало откладку коконов на 1 червя.

Рис. 1. Общая численность E. fetida

Рис. 2. Изменение общей численности E. fetida при культивировании в почвах, загрязненных отработанным автомобильным маслом(p<0,05) (с указанием величины абсолютной погрешности с достоверностью 95 %). Цифры от1 до 12 соответствуют вариантам эксперимента 1, указаны в табл.

Рис. 3. Изменение концентрации отработанного автомобильного масла в процессе рекультивации

В контрольном образце (обр. 1) без внесения биопрепарата «Байкал – Эм-1» общая численность E. fetida увеличилась в 7,6 раз (p<0,001) и достигла 76 особи в одном образце, (относительная погрешность составила 10-20 %, рис. 2а) а при внесении микробиологического препарата «Байкал Эм-1» общая численность червей возросла в 20 раз и составила 203 особи (относительная погрешность составила от 5 до 10 %). При введении в состав почвы 20 г/кг отработанного автомобильного масла (обр.3 и 4) общая численность червей увеличилась в 3 раз и достигла 30 особей (относительная погрешность составила 10 %). При внесении отработанного автомобильного масла 40 г/кг, общая численность червей увеличилась в 2 раза, а при внесении биопрепарата «Байкал – Эм-1» при том же содержании масла (обр. 6) в 2 раза (относительная погрешность 20-50 %)(p<0,05).

При внесении в почву 60 – 100 г/кг отработанного автомобильного масла отмечалась 90 % выживаемость червей, а при внесении микробиологического препарата «Байкал Эм-1» выживаемость снизилась до 43 %. Для образцов 8,10, 12 содержание отработанного автомобильного масла в каждом образце составляло 60-100 г/кг (p<0,05). Общая численность в варианте 8, при внесении отработанного автомобильного масла 60 г/кг увеличилась в 2 раз и составляла 20 особей на сосуд (рис. 1) (относительная погрешность составила 35 %)(p<0,05). В варианте с концентрацией отработанного автомобильного масла 80 и 100 г/кг общая численность навозных червей оставалась неизменной (относительная погрешность 10 %)(p<0,05).

Разложение углеводородов отработанного масла

Эффективность и скорость деградации масла зависит от концентрации его в почве. При внесении низких концентраций отработанного масла 20-40 г/кг почвы процесс рекультивации занимал 4 месяца, в ходе которого концентрация углеводородов снижалась на 97-99 %. Внесение микробиологического препарата оказывало существенное влияние на процесс деградации масла. В процессе вермикультивирования содержание нефти снижалось на 60-90 %.

При внесении низких концентраций масла 20 г/кг эффективность разложения 75 % (5,4 г/кг), а при внесении микробиологического препарата «Байкал-Эм» – 99 % (0,2 г/кг). При внесении масла в почву 40 г/кг в варианте с навозным червем концентрация масла снизилась до 4,5 г/кг (эффективность 88 %), а при внесении микробиологического препарата эффективность разложения углеводородов составила 96 % (1,6 г/кг). При внесении масла в почву 60 г/кг в варианте с навозным червем концентрация снизилась до 5,1 г/кг, эффективность- 91 %, а при внесении микробиологического препарата эффективность составила 86 % (8,3 г/кг). При внесении масла в почву 80 г/кг в варианте с навозным червем концентрация снизилась до 18 г/кг, эффективность – 80 %, а при внесении микробиологического препарата содержание масла снизилось до 15 г/кг (эффективность 82 %). При концентрации масла 100 г/кг в варианте с навозным червем концентрация масла снизилась до 10 г/кг, эффективность 90 %, а при внесении микробиологического препарата содержание масла снизилось до 27 г/кг (эффективность 73 %).

Заключение

В нашем исследовании отмечена высокая выживаемость дождевых червей до 100 % при низких концентрациях отработанного масла до 50 гр/кг. Низкие концентрации масла 20-40 г/кг оказывают стимулирующее влияние на все виды дождевых червей, стимулируя откладку коконов. Внесение микробиологического препарата снижало выживаемость и репродуктивный потенциал E. fetida до 50 %. При внесении концентраций масла от 20 до 100 г/кг отмечалась 80–100 % выживаемость E. fetida и стабильный рост численности червей, но внесение микробиологического препарата при высоких концентрациях масла более 50 г/кг снизило выживаемость до 50–60 %. При внесении в почву 60–100 г/кг масла общая численность увеличилась в 3 раза, а внесение микробиологического препарата вызвало гибель 50 % половозрелых особей. Вероятно, микроорганизмы облегчали проникновение масла через пищеварительный тракт и усиливали токсический эффект. Эффективность и скорость деградации масла зависит от концентрации его в почве. При внесении низких концентраций отработанного масла 20-40 г/кг почвы процесс рекультивации занимал 4 месяца, в ходе которого концентрация углеводородов снижалась на 97-99 %. Внесение микробиологического препарата оказывало существенное влияние на процесс деградации масла. В процессе вермикультивирования содержание масла снижалось на 60-90 %.