Прогрессирование специфического туберкулезного процесса происходит на фоне снижения функциональных возможностей фагоцитирующих клеток на фоне повышенного образования в организме активных форм кислорода (АФК) и снижении антиоксидантных механизмов защиты [3, 7, 10]. Накапливается все больше данных о том, что большое значение в механизмах защиты и повреждения при туберкулезном процессе могут иметь высокоактивные соединения азота (ВСА) [3, 7, 8]. Однако окончательной ясности о роли этих биологически активных молекул в механизмах защиты и повреждения при туберкулезе нет. Лейкоциты крови принимают активное участие в генерации АФК и ВСА [3, 7]. В последние годы появляется все больше сообщений о том, что именно лейкоциты крови могут играть существенную роль в неспецифической резистентности к МБТ [3, 7]. Вполне вероятно эффект защиты происходит за счет генерации таких агрессивных молекул как АФК и ВСА, но сведений посвященных этим вопросам недостаточно.

Целью настоящего исследования было уточнить значение функционально – метаболических особенностей лейкоцитов крови в механизмах защиты и повреждения у животных с разной степенью устойчивости к туберкулезу после заражения их МБТ.

Материалы и методы исследования

Для проведения эксперимента были взяты устойчивые к МБТ крысы, мыши, и высокочувствительные к МБТ морские свинки.

Исследования проводились на беспородных белых крысах, мышах и морских свинках из питомника Уральского НИИ Фтизиопульмонологии, которые содержались в стандартных условиях вивария согласно принятым требованиям. Всего в исследованиях было 16 морских свинок (10 опытных и 6 контрольных) в возрасте 3–4 месяца массой 250–300 г, 16 крыс (10 опытных и 6 контрольных) в возрасте 3 месяца массой 200–250 гр. и 25 мышей (15 опытных и 10 контрольных) массой 50 гр. План эксперимента был рассмотрен и утвержден биоэтической комиссией УНИИФ.

Для воспроизведения экспериментального туберкулеза использовали музейный штамм микобактерий центрального НИИ туберкулеза Н37Rv (1993 г.). Морские свинки заражались 2-х недельной живой культурой в паховую складку в дозе 0,001 мг, крысы дозой 0,1 мг, мыши дозой 0,1 мг в хвостовую вену. Выведение животных из эксперимента производилось через 6 недель после заражения при развитии у морских свинок генерализованного туберкулеза.

Для определения исследуемых показателей у животных под наркозом забирали кровь из сердца. Для биохимических исследований были заморожены образцы сыворотки крови и лейкоцитарной взвеси. Проводили исследования фагоцитарной активности лейкоцитов крови общепринятыми методами, метаболической активности лейкоцитов в НСТ тесте. При помощи иммуноферментного анализатора в плазме крови и лейкоцитах исследовали уровень суммарных перекисей липидов (по показателям OXYSTATA) и стабильных производных (нитрата) оксида азота, количество свободных аминокислот и глутатиона.определяли при помощи газожидкостной хроматографии.

В плазме крови находили содержание аскорбиновой и дикетогулоновой кислот общепринятыми методами.

В лабораторной части эксперимента использовали следующие методы и диагностические тест-системы:

1. У всех животных были подсчитаны процент фагоцитирующих нейтрофилов, число поглощенных бактерий на 1 мкл, базальный и стимулированный продигиозаном уровни НСТ-теста, коэффициент стимуляции

2. OXYSTAT определяли при помощи набора BiomedicaGRUPPE

3. Производные оксида азота (нитрит) находили по методу RandDSystems,

4. Содержание глутатиона восстановленого и окисленного, а так же свободных аминокислот плазмы крови и лейкоцитов, определяли на газожидкостном анализаторе ААА 339М «Микротехника», при этом перед исследованием на содержание аминокислот плазму крови и лейкоцитарную взвесь депротеинезировали 50 % раствором трихлоруксусной кислоты.

5. Содержание аскарбиновой и дикетогулоновой кислот определяли с использованием парадиметиламинобензальдегида [2].

При обработке полученных данных мы применяли непараметрические методы с использованием программы Excel. Оценка степени достоверности различий между группами оценивалась по критерию «U» Манна–Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

На момент выведения из эксперимента у всех зараженных морских свинок развивался генерализованный туберкулез с преимущественным поражением селезенки, печени, лимфоузлов, легких. У крыс и мышей не смотря на то, что доза заражения была в 100 раз большей, туберкулезный процесс не развивался.

Установлено, что у животных с различной видовой устойчивостью к МБТ генерация ВСА в организме в ответ на заражение музейным штаммом МБТ-Н37 rv значительно отличается. Так у морских свинок количество конечного продукта окисления ВСА – нитрита в плазме крови возрастает после заражения от 56,0 ± 11,2 в контроле до 88,8 ± 10,5 мкмоль/л, то есть примерно в 1,6 раза( р < 0,01 к контролю), тогда как у крыс достоверного увеличения этого вещества к контролю не наблюдается (26,14 – 31,9 мкмоль/л соответственно). Следует отметить, что морские свинки располагают вообще большими ресурсами ВСА, поскольку в контроле содержание нитрата в плазме у этих животных более чем в 2 раза превосходит таковой у крыс (р < 0,01).

Обращает на себя внимание, что у морских свинок так же гораздо более высокие показатели суммарных перекисей липидов определяемых по оксистату. Их содержание в крови у здоровых морских свинок составляет 394,46 ± 54,8 мкмоль/л., в то время как у зараженных – 609,53 + – 143,40 (р < 0,01). У крыс их содержание 145,4 ± 31,6 – 163,8 ± 18,8 мкмоль/л соответственно, то есть, изменений после заражения практически не наблюдается (р > 0,05). Разница между морскими свинками и крысами по уровню суммарных перекисей в контрольных группах составляет, примерно, в 2 раза (р < 0,01).

Но после заражения МБТ это различие становится почти 4х кратным. При этом у крыс увеличения показателей оксистата практически не наблюдается, а у морских свинок его уровень резко возрастает (почти в 2 раза – p < 0,01).

Нитрит является конечным метаболитом ВСА генерируемых эндотелием, фагоцитами, а оксистат – показатель конечных метаболитов превращения свободных радикалов кислорода – АФК [4, 6]. Поэтому динамика значений нитрита и оксистатав крови является неким интегральным показателем способности организма генерировать ВСА и АФК. А общее состояние организма животных после заражения отражает его способность оперировать с этими биологически активными и достаточно агрессивными молекулами.

Защитный или повреждающий эффект АФК и ВСА при туберкулезе зависит от состояния антиоксидантной и других защитных систем организма [4,6] и модулируется такими метаболитами как аскорбиновая кислота, глутатион восстановленный или окисленный, таурин, аргинин и рядом других биологически активных веществ синтезируемых в печени и других органах [5, 8, 9]. Было установлено, что в печени крыс после заражения значительно возрастает количество аскорбиновой кислоты (АК) (почти в 3 раза – р < 0,01), а у морских свинок (которые в отличии от крыс не могут ее синтезировать) наблюдается ее более чем 2 кратное уменьшение (р < 0,01) (табл. 1).

Противоположные изменения претерпевают и метаболиты АК. В печени морских свинок увеличивается содержание дикетогулоновой кислоты (ДКГК) (448 мкг/г в контроле до 864 мкг/г после заражения р < 0,05), а у крыс существенных изменений количества этого метаболита не происходит (р > 0,05).

Противоположную направленность имеют изменения количества такого метаболита как глутатион, имеющего тесную взаимосвязь с обменом АК.

У морских свинок в печени после заражения значительно увеличивается количество глутатиона окисленного (Г-SS-Г) (до 1438,8 мкг/г – р < 0,01), который и в контроле был несколько больше, чем у крыс. Надо отметить, что и ресурс глутатиона восстановленного (Г-SH) в печени морских cвинок гораздо выше, чем у крыс (712,5 против 433,2 мкг/г – различие достоверно – р < 0,01) (табл. 2).

Как видим в защитных механизмах к воздействию МБТ у крыс преобладает АК и усиливается ее биосинтез, тогда как у морских свинок после заражения МБТ содержание АК резко уменьшается, но увеличивается ее метаболит ДКГК, который может включаться в метаболические процессы необходимые для поддержания глутатиона в восстановленном состоянии (пентозный цикл) [7, 8]. При этом общее количество глутатиона у морских свинок резко возрастает и он интенсивно окисляется. АК и глутатион мощные антиоксиданты и биологические молекулы, выполняющие важнейшую защитно-адаптивную функцию на метаболическом уровне. В том числе, и по отношению к туберкулезной инфекции [3, 5, 7, 8]. Как видим, преобладание АК у крыс на этом уровне связано с их высокой устойчивостью к МБТ, а преобладание глутатионовой системы у морских свинок делает их абсолютно беззащитными к туберкулезу.

При этом установлено, что помимо АК в высокой устойчивости крыс к МБТ может иметь отношение такой метаболит как таурин, являющийся антиоксидантом, стабилизатором мембран и стимулятором фагоцитарных реакций организма [5, 9]. Среди всех свободных аминокислот тканей крыс таурин составляет до 50 % и более [5], а у морских свинок таурина в тканях на порядок, а то и на 2 меньше, чем у крыс. Так, например, в костном мозге крыс содержание таурина составляет 5859,1 ± 620,4 а у морских свинок 468,7 ± 71,1 мкг/г, почти столь же значительны отличия и по содержанию глутатиона восстановленного в костном мозге (Г-SH) 1199,4 ± 142,5 против – 422,9 ± 67,1 мкг/г (во всех случаях р < 0,01).

Таблица 1

Содержание аскорбиновой кислоты в печени морских свинок и крыс после заражения МБТ(в мкг/г)

Таблица 2

Содержание глутатиона восстановленного и окисленного в ткани печени морских свинок и крыс после заражения МБТ (в мкг/г сырого веса ткани)

Примечание. * Отмечены результаты статистически достоверно отличающиеся от контроля (р < 0,05); ** – р < 0,01.