Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Управление процессами регенерации тканей после травм остается одним из наиболее актуальных направлений современной восстановительной медицины. С этой целью в последние годы активно изучаются возможности клеточной терапии, различных физических факторов или их сочетаний [5, 11, 12]. Основным потенциальным клеточным материалом, используемым для восстановительной терапии, являются мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки взрослого организма (ММСК).

ММСК представляют собой гетерогенную популяцию клеток разной степени коммитированности, которые активно вовлекаются в физиологическое и регенеративное ремоделирование тканей. Эти клетки способны подавлять иммунные и воспалительные реакции, выделяют большое количество биологически активных веществ, ускоряющих протекание реакций обмена в тканях, активизируют работу уже имеющихся высокоспециализированных клеток, обладают способностью к пролиферации и дифференциации в другие типы клеток [7]. ММСК могут быть получены из различных источников, но наиболее перспективным и доступным источником клеточного материала считается стромально – васкулярная фракция жировой ткани [18].

Изучение изменений характеристик ММСК in vitro под воздействием традиционных методов физиотерапевтического воздействия (УЗ, магнитотерапия, лазерное излучение) продолжает оставаться предметом пристального внимания, т.к. является важнейшим этапом для понимания тонких механизмов, происходящих в организме человека и/или экспериментальных животных.

Одним из основных физических факторов, традиционно применяемых для восстановительной терапии травматических повреждений, является ультразвук (УЗ) низкой интенсивности, терапевтический эффект которого обусловлен улучшением микроциркуляции, активацией тканевых ферментов, повышением проницаемости клеточных мембран и др. [9, 17]. Однако механизмы взаимодействия ультразвука с ММСК окончательно не ясны и продолжают активно изучаться на различных экспериментальных моделях [8, 16].

Исследование воздействия УЗ на морфологические характеристики и функциональную активность ММСК в системе in vitro поможет не только понять процессы, происходящие в организме при их сочетании [15], но и определить тактику применения при составлении программ реабилитации для каждого пациента.

Цель работы – изучение воздействия УЗ низкой интенсивности в терапевтических дозировках на морфофункциональные характеристики ММСК, выделенных из жировой ткани пациентов с заболеваниями суставов кисти, на модели in vitro.

Материалы и методы исследования

Работа проводилась на 5 штаммах культур ММСК стромально-выскулярной фракции жировой ткани. Источником клеточного материала были биоптаты жировой ткани пяти пациентов с поражением мелких суставов кисти, находившихся на лечении в отделении микрохирургии ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, у которых во время реконструктивных операций забирали 1–2 мл жировой ткани.

В исследование вошли трое мужчин и две женщины с различными повреждениями кисти: два человека с болезнью де Кервена, двое – с посттравматическим артрозом и один пациент с посттравматической деформацией кисти после комбинированной термической травмы (ожог + отморожение).

Каждый пациент дал добровольное информированное согласие на участие в исследовании, протокол которого был утвержден Локальным Этическим комитетом (протокол № 6 от 14.04.2015 года) и Ученым советом ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России.

Клетки выделялись с помощью тепловой ферментативной обработки коллагеназой (ООО «ПанЭко, Москва) в течение часа при 37°С и культивировались в среде α – MEM с добавлением 20 % телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС), глутамина, антибиотиков (пенициллин/стрептомицин) при абсолютной влажности, 37°С, 5 % СО2. Были использованы среды и реактивы фирмы ООО «ПанЭко» (Москва, Россия), пластик фирмы «Costar».

По достижении 50 % субконфлюэнтного монослоя культуру пересевали. В экспериментах использовали культуру 3–4 пассажа. Исходная плотность клеток составляла 5 тыс./см2. Для эксперимента клетки засевали на восемь чашек Петри («Costar»), каждая площадью 20 см2.

Перед началом эксперимента определяли фенотип клеток на цитофлюориметре «Becman Coulter», используя панель моноклональных антител «Becman Coulter»: CD 45 PC5, CD 14 PC5, CD HLA-DR PC7, CD 34 PC7, CD 90 Fitc, CD 105 PE, CD 44 Fitc, CD 73 PE, CD 10 PC7, CD 13 PC5 с соответствующими изотипическими контролями.

Через 24 часа после пересева культуру в чашках опытных серий подвергали двухминутному воздействию ультразвуком низкой интенсивности с помощью портативного аппарата для комбинированной физиотерапии «Sonopuls-492 new» фирмы «Enraf Nonius».

Использовали излучатель диаметром 0,8 см2. Воздействие осуществляли в импульсном режиме, согласно программе «Повреждения суставов, костной и мышечной ткани», изложенной в «Инструкции пользователя на русском языке Sonopuls 492». Выбор импульсного режима определялся тем, что при нем слабее проявляются тепловые эффекты. Параметры программы соответствовали частоте работы излучателя 1МГЦ – 3МГц. Интенсивность воздействия составляла 0,05 Вт/см2, что соответствовало максимальному уровню безопасности, обусловленному международным стандартом IEC. Частота импульсов установлена 100Hz. Коэффициент заполнения импульсов (скважность) – 5–20 %. Воздействие осуществлялось через слой ростовой среды (5 мм). Предварительно обработанная 70 %. спиртом и промытая стерильной деионизированной водой головка датчика погружалась в среду на глубину 1 мм. Тщательно контролировалось отсутствие контакта с клеточным слоем.

Через каждые 24 часа воздействие повторяли. Всего культура подвергалась воздействию пять раз по аналогии с курсом лечения в клинической практике.

Контролем служила интактная культура, чашки с которой на время воздействия извлекались из инкубатора. В течение всего эксперимента смена среды не проводилась.

Для наблюдения за состоянием культуры в процессе роста использовали метод светлого поля и фазового контраста. Микроскопию и видеоархивирование проводили с помощью инвертированного микроскопа «Leica DM IL», оснащенного видеокамерой и программой «Leica IM 1000», при увеличении 50х, 100х, 200х перед началом воздействия и затем через каждые 24. По окончании эксперимента в опытных и контрольных сериях определяли плотность клеток на единицу площади культурального сосуда, жизнеспособность клеток, фенотип клеток культуры, отбирали и замораживали пробы ростовой среды для последующего определения протеинов и факторов роста.

Концентрацию и жизнеспособность клеток подсчитывали в камере Горяева и счетчике клеток «Countes», Invitrogen, США. При использовании камеры Горяева подсчитывали не менее 5 полей зрения в каждой группе, как опытной, так и контрольной. Для оценки жизнеспособности использовали прижизненный краситель трипановый синий.

При определении секреторной активности клеток культуры определяли уровень одного из ключевых протеинов межклеточного матрикса – фибронектина, трансформирующего фактора роста – TGF-β1, VEGF.

Определение фибронектина и факторов роста проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов группы компаний ВСМ «Биохиммак». Величину оптической плотности регистрировали на анализаторе «Sunrise» (Австрия) с использованием программы «Magellan», которая в автоматическом режиме позволяет строить калибровочную кривую и определять концентрацию исследуемых веществ.

Результаты исследования обработаны методами непараметрической статистики с применением критерия парных сравнений Вилкоксона при помощи пакета программ STATSTICA 6.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Культуры, используемые в эксперименте, соответствовали минимальным критериям для ММСК человека, установленным Интернациональным обществом по клеточной терапии [9].

Морфологические характеристики культуры в процессе роста, как в контрольных, так и в опытных сериях, соответствовали критериям мезенхимальных клеток. Это были фибробластоподобные клетки, звездчатой или веретеновидной формы с выраженными отростками, плотными ядрами, формирующие на поверхности пластика типичную картину монослоя в виде «завитков».

Фенотип клеток в процессе исследования не менялся и оставался стабильным. Определялись маркеры мезенхимальных клеток: CD 90+, CD 105+, CD 44 +, CD 73 +, CD 10+, CD 13 + при отсутствии панлейкоцитарного маркера CD 45– и маркеров CD 34–, HLA – DR-, CD 14–.

Следует подчеркнуть, что жизнеспособность клеток под воздействием УЗ не нарушалась, и не отмечалось достоверных отличий в количестве жизнеспособных клеток в опытных сериях по сравнению с контрольными сериями. Полученные результаты согласуются с данными Ефимовой Н.Н. и соавт., 2007 [3]; KiTaek Lim and al, 2013 [14], отмечавшими отсутствие отрицательного воздействия УЗ низкой интенсивности на морфологические характеристики и жизнеспособность клеток в культуре.

В каждом эксперименте в опытных сериях зафиксирована отчетливая тенденция к стимуляции пролиферации ММСК по сравнению с таковой в контрольных сериях (табл. 1), которая не зависела от индивидуальных характеристик и генеза каждого штамма.

Таблица 1

Изменение плотности ММСК в культуре после воздействия УЗ средняя (Min – Max)

Аналогичные данные получены при исследовании воздействия УЗ на процессы пролиферации дифференцированных клеток мезенхимального дифферона – дермальных фибробластов человека в системе in vitro [6], при исследовании воздействия УЗ на модели МСК крысы [8]. Одной их важнейших функций клеток мезенхимального ряда является синтез компонентов внеклеточного матрикса, в частности коллагена и гликопротеинов. Фибронектин – мультифункциональный высокомолекулярный гликопротеин, содержащийся в биологических жидкостях и тканях и участвующий в регуляции функций лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоэндотелиальной системы, пролиферации и дифференцировке фибробластов и эпидермальных клеток и играющий важнейшую роль в процессах заживления ран [4;13]. Фибробласты являются одними из основных продуцентов фибронектина, играющего важнейшую роль в функционировании межклеточного матрикса. Показано, что в процессе роста дермальных фибробластов человека в монослое в течение первых двух суток происходит внутриклеточное накопление этого белка, а, начиная с третьих суток, фибронектин накапливается в ростовой среде [2]. Аналогичная динамика накопления фибронектина отмечена нами ранее и в культурах ММСК, выделенных из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека [1]. Под воздействием низкоинтенсивного УЗ в ростовой среде в опытных сериях всех исследованных штаммов монослойных культур ММСК фиксируется увеличение уровня фибронектина по сравнению с уровнем этого протеина в контрольных сериях (табл. 2).

Можно предполагать, что накопление фибронектина в ростовой среде связано с накоплением клеточной биомассы, а усиление пролиферации под воздействием УЗ, приводящее к образованию большего количества клеток сопровождается и усилением продукции фибронектина. В литературе параллельно активации пролиферации отмечают и накопление коллагена или в ростовой среде, или непосредственно в матрице около клеток, увеличивающееся под воздействием доз УЗ, близких к терапевтическим [6].

Таблица 2

Изменение уровня фибронектина в ростовой среде ММСК после воздействия УЗ в нг/мл – cредняя (Min – Max)

Характер изменения уровня факторов роста TGF-β и VEGF под воздействием УЗ в различных штаммах ММСК отличался от направленности изменений пролиферации и накопления фибронектина. Уровень TGF-β в трех культурах после пятикратного воздействия УЗ не менялся, в то время как в двух других увеличивался (табл. 3). Уровень VEGF после воздействия УЗ в двух культурах не менялся, в двух – фиксировалась тенденция к увеличению в опытных сериях по сравнению с контрольными сериями, а в одной культуре отмечалось снижение продукции этого протеина (табл. 4).

Таблица 3

Изменение уровня TGF-β в ростовой среде ММСК после воздействия УЗ в пг/мл – cредняя (Min – Max)

Таблица 4

Изменение уровня VEGF в ростовой среде ММСК после воздействия УЗ в пг/мл – cредняя (Min – Max)

Известно, что семейство VEGF – факторов играет важнейшую роль в регуляции процессов ангиогенеза, в то время как группа трансформирующих факторов роста TGF-β участвует в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Оба изучаемых фактора имеют значение и в регуляции патологических процессов. Факторы семейства TGF-β, ингибируя пролиферативную активность, предотвращают размножение недифференцированных (мутировавших – опухолевых клеток). Васкулоэндотелиальные факторы (VEGF), играя важную роль в поддержании стабильности эндотелия и физиологическом неоангиогенезе, могут участвовать в процессах неоваскуляризации в патологических ситуациях, в частности, в росте атеросклеротической бляшки и неопластических процессах при онкогенезе.

Поэтому понимание направленности изменений указанных факторов, происходящих в различных культурах под воздействием УЗ, чрезвычайно важно для правильного и безопасного его использования при различных патологических состояниях.

Выводы

1. Пятикратное воздействие УЗ низкой интенсивности в терапевтических дозировках не влияет на жизнеспособность, фенотип и морфологию ММСК в культуре.

2. Под воздействием терапевтических доз УЗ независимо от особенностей культуры ММСК и ее генеза (пол, возраст донора материала, характера повреждающего фактора) отмечается отчетливая тенденция к увеличению пролиферативной активности и активации синтеза фибронектина.

3. Продукция VEGF и TGF-β в тех же культурах меняется неоднозначно.

4. Целесообразно проведение дальнейших исследований на штаммах культур ММСК, полученных от пациентов с различной патологией.