Малые молекулы представляют собой актуальной предмет научных исследований. Тем не менее, по данным Wiley Online Library 2011 года, изучение этих взаимодействий по количеству публикаций отстает от исследований таких типов взаимодействий как белок-белковое, белок-ДНК, белок-РНК, первые публикации о белок-метаболит взаимодействиях появились в 2009 году. В настоящее время значительные усилия исследователей направлены на открытие малых молекул, обладающих характерными функциональными свойствами, определяющих клеточный фенотип [1–3].
В литературе описаны примеры разнонаправленного действия белок-лиганд связывающих взаимодействий на структуру белка [4–6]. С использованием метода масс-спектрометрии DARTS (Drug Affinity Responsive Target Stability), основанного на принципе, что лиганд стабилизирует структуру белковой молекулы, и она становится устойчивой к действию протеолитических ферментов, показано, что протеолиз субтилизином цитоплазматического белка иммунофилина явно снижается в присутствии молекулы рапамицина [7]. Белки могут дестабилизироваться в присутствии лигандов, например, фермент топоизомераза-1 и лиганд – камптотецин [8].
Метаболические пути являются динамичными и тесно взаимосвязанными, что чрезвычайно удобно для их регуляции [9–11]. Эндогенные метаболиты составляют численное большинство молекул в клетке, и взаимодействия белок-метаболит являются распространенным явлением [12]. Метаболиты могут выступать не только в качестве субстратов и продуктов ферментативных реакций, но и служить регуляторами сигнальных путей и модуляторами функций, как отдельных молекул, так и биохимических каскадов [13–15].
Совокупность взаимодействия всех белков, характерная для данного организма, получила название «интерактом». Этот термин был предложен группой французских ученых во главе с Б. Жаком в 1999 году [16]. Установлено, что размер интерактома у дрожжей S. Cerevisiae, по одним данным, может составлять до 10–17 тысяч, а по другим – 25–35 тысяч взаимодействий. Предполагается, что размер интерактома человека может быть образован примерно 650 тысячами взаимодействий белков. В человеческой клетке предположительно около 39 тысяч белок-белковых взаимодействий. Число взаимодействующих пар белков человека в 10 раз больше, чем у Drosophila melanogaster. Эти данные позволяют высказать предположение о том, что размер интерактома зависит от уровня сложности организма [17,1 8].
Определение взаимодействующих пар белков позволяет составлять интерактомные карты, которые полезны для понимания функционирования белков. В настоящее время большое количество исследований посвящено анализу и уточнению уже имеющихся данных взаимодействия белков, с использованием различных экспериментальных и компьютерных методов. Анализ интерфейсов может быть проведен в группе белков, участвующих в конкретном заболевании. Было установлено, что интерфейсы белок-белковых комплексов при раке молочной железы и колоректальном раке, а также лейкемии были меньше и более плотно упакованы. В литературе имеются данные о похожих интерфейсах, и предполагается наличие шаблонов интерфейсов [19–21].
Центральное место в регулировании метаболизма углеводов занимает пируват. В исследованиях D.K. Bricker были выявлены два белка – митохондриальный пируват-переносчик-1 и митохондриальный пируват-переносчик-2, необходимые для транспорта пирувата в митохондрии млекопитающих. Белки функционируют как единый гетеродимерный комплекс во внутренней мембране митохондрий. Показано ингибирующее действие α- цианоцинамата – производного уксусной кислоты на транспортную функцию митохондриальных пируват-переносчиков [22].
В работах K.D. Ju показано, что пируват является эндогенным антиоксидантом и обладает противовоспалительными свойствами. Проведенные эксперименты на крысах, больных диабетом, позволили предположить, что пируват может защищать крыс от развития нефропатии путем ингибирования НАДФН-оксидазы [23].
Показано, что пируват может регулировать интенсивность взаимодействия антигена с антителом. Преинкубация эритроцитов с пируватом приводит к уменьшению экспонирования антигенов А и В на поверхности эритроцитов или к изменению их конформации, что вызывает уменьшение скорости гемагглютинации и снижение количества комплексов антиген-антитело в эритроцитах. При этом внесение пирувата к моноклональным антителам перед началом их взаимодействия с антигенами эритроцитов А(II) и В(III) группы крови оказывает противоположный эффект, вызывая ускорение гемагглютинации [24].
Оценка антиген–антительного взаимодействия эритроцитов исследуемых групп крови методом проточной цитофлуориметрии подтверждает общую тенденцию: пируват способствует угнетению процесса агглютинации эритроцитов В(III) и АВ(IV) групп крови. При этом пируват и этанол сильнее влияют на специфичность эпитоп-паратоп взаимодействия антигена В. Весьма вероятно, что в основе неоднотипной тенденции выявленных сдвигов лежат различия в строении антигенных детерминант антигенов А и В, обладающих различным химическим строением [25].
Изучение молекулы пирувата «in silico» с использованием компьютерной системы PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances), позволило выявить способность пирувата оказывать гиперхолестеролемическое, иммуномодулирующее, противовоспалительное, обезболивающее, фибринолитическое, цито- и гемопротекторное, антитоксическое и другие действия [26].
Лактат является одним из наиболее распространенных метаболитов в организме млекопитающих и образуется во всех клетках организма. Традиционно лактат рассматривался как альтернативный глюкозе источник энергии и буферный тупик пирувата. В последнее время было показано, что лактат может пересекать гематоэнцефальный барьер и оказывать метаболическое воздействие на головной мозг, а также выступать в качестве сигнальной молекулы [27]. Важно отметить, что некоторые из нейронов в гипоталамусе чувствительны к лактату. Показано, что экзогенный лактат в концентрации 5 мМ эффективно закрывает АТФ-чувствительный калиевый канал в нейронах с повышением концентрации АТФ в клетке [28]. В работе J. Yang описана модуляция лактатом активности ионотропного рецептора глутамата (NMDA), который может быть одновременно восприимчив как к эндогенным лигандам-агонистам, так и к эндогенным лигандам-антагонистам, в отличие от других рецепторов. Лактат активирует NMDA-рецептор и сигнальный путь, содержащий одну из митоген-активируемых протеинкиназ с последующим увеличением внутриклеточного кальция. Параллельно с этим лактат увеличивает уровень внутриклеточного НАДН, модулируя редокс-состояния нейронов. Эти данные показывают, что лактат может выступать в качестве сигнальной молекулы для нейрональной пластичности, т.е. обладает нейропротекторным действием. Интересно, что пируват, который должен иметь противоположный эффект на состояние окислительно-восстановительного потенциала, был полностью неактивным в этих экспериментах [29]. В 2008 и 2012 году две группы исследователей сообщили, что L-лактат выступает лигандом и агонистом G-белка рецептора 81, активация которого приводит к ингибированию липолиза в адипоцитах [30]. По мнению Hashimoto T. и Brooks G.A., лактат является сигнальной молекулой, которая вызывает адаптивную модуляцию собственного метаболизма в митохондриях за счет активации экспрессии генов синтеза митохондриального белка-транспортера лактата, митохондриальной ЛДГ и цитохромоксидазы [31].
Использование метода компьютерного прогнозирования PASS, основанного на анализе взаимосвязей «структура–активность», позволило получить многопрофильные и разнообразные данные, показывающие вероятность влияния лактата на межмолекулярные процессы поддержания метаболического баланса путем регуляции белкового, углеводного, липидного обменов, антиоксидантных процессов, тканевого дыхания [32].
Широкий спектр физиологических эффектов в организме имеет этанол, но, как именно он действует, чтобы проявлять эти эффекты, до сих пор малопонятно. В настоящее время появились публикации о дискретных, идентифицированных сайтах связывания этанола белками и о том, что белок-лигандное взаимодействие зависит от концентрации спирта [33].
Активность аденилатциклазы – фермента, запускающего цАМФ- сигнальный путь, повышается фармакологически соответствующими концентрациями этанола. Стимулирующее действие этанола на активность аденилатциклазы позволило предположить наличие структурных элементов (участков), модулированных этанолом. Выявлено, что первый участок расположен в области 28-го аминокислотного остатка домена С на N-конце фермента, а второй – в области 140-го аминокислотного остатка С-концевой области фермента [34].
Установлено, что этанол может регулировать фермент-субстратные взаимодействия дегидрогеназ: глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерол-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Увеличение активности исследуемых ферментов под влиянием этанола в гемолизате крови было в 2,5–3 раза выше, чем в изолированной среде (с чистыми препаратами ферментов) [35, 36].
Визуализация комплексов антиген–антитело с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа дала возможность оценить особенности действия этанола в зависимости от групповой принадлежности крови индивидуумов. Этанол по-разному влияет на специфические белок-лигандные взаимодействия: антиген А с терминальным N-ацетилгалактозамином показывает большую устойчивость к действию малых молекул, чем антиген В с терминальным моносахаридом D-галактозой [37].
Современные исследования направлены на изучение сайтов и механизмов связывания этанола рецепторами глицина. Общеизвестно, что рецептор состоит из 5 гомологичных субъединиц двух типов – α и β, каждая субъединица содержит трансмембранный домен, имеющий четыре α- спиральных участка. Показано, что аминокислотные остатки Сер 267 во втором α-спиральном участке и Ала 288 в третьем α-спиральном участке имеют решающее значение для аллостерической модуляции этанолом функционирования глицинового рецептора, и мутации в этих местах могут влиять на чувствительность к этанолу [38].
Биохимические процессы в живых клетках в значительной степени регулируются белок-лигандными взаимодействиями, которые играют важнейшую роль в жизнедеятельности клеток. Нарушение взаимодействий между белками лежит в основе многочисленных заболеваний [39]. Многие ключевые функции клетки регулируются комплексообразованием белков. Функция, активность и специфичность таких комплексов зависят от характера белок-лигандных взаимодействий. Кроме того, в постгеномной эре изучение метаболических сетей обеспечивает понимание молекулярной эволюции, реакции клеток на внешние и внутренние стимулы и помогает выяснить функции белков [40].