Ревматоидный артрит (РA) является хроническим аутоиммунным заболеванием, характеризующимся наличием ревматоидного фактора (РФ) и антител к циклическому цитруллинированному пептиду.
Из всех иммуновоспалительных ревматических заболеваний РА относится к категории наиболее распространенных и социально значимых болезней. Им болеет от 0,5 % до 2 % взрослого населения нашей планеты, причем около 70 % – это женщины. РА поражает людей молодого, трудоспособного возраста и характеризуется тяжелым течением, ранней инвалидностью, снижением качества жизни, неблагоприятным прогнозом. Это одно из самых дорогостоящих заболеваний, что ведет к значительной социально-экономической нагрузке как на самого больного, так и на общество в целом. Кроме того, РА сопровождается коморбидными состояниями: кардиоваскулярными (инфаркт миокарда, инсульт, тромбоз сосудов), онкологическими, инфекционными, с развитием которых связан высокий риск преждевременного летального исхода. Основными составляющими элементами борьбы с РА являются: ранняя и своевременная диагностика, выяснение этиопатогенетических механизмов развития заболевания, профилактика и адекватное лечение. На современном этапе ко многим аспектам еще остаются вопросы. Поэтому исследования РА не потеряли своей актуальности и в настоящее время.
На сегодняшний день нет единого взгляда на этиопатогенез РА. Существует множество теорий развития заболевания. Но большинство исследователей склоняются к тому, что РА – многофакторное заболевание и в его возникновении и прогрессировании участвуют как минимум 3 фактора: инфекционный, иммуногенетический и аутоиммунный.
Наметившийся в XXI веке прогресс в плане раскрытия механизмов патогенеза связан с выяснением некоторых звеньев аутоиммунного ответа. В результате этого появилась возможность поиска новых лекарственных препаратов, направленных на блокирование отдельных патогенетических звеньев. Однако единая, научно обоснованная, концепция патогенеза РА так и не разработана. Поэтому окончательную точку в этом вопросе ставить еще рано.
В последние годы мировым научным сообществом активно обсуждается роль NETоза (процесса образования нейтрофилами внеклеточных ловушек) в возникновении и прогрессировании различных патологических состояний организма, в том числе и аутоиммунных [1].
Высказываются гипотезы, что компоненты экстрацеллюлярных ловушек могут выступать этиологическим фактором, инициируя аутоиммунное воспаление при РА, а также способствуют его хронизации, выступая в качестве факторов аутоагресии [2, 3].
Фактически ловушки представляют собой сетеподобные структуры, сотканные из нитей ядерной ДНК, гистонов, цитоплазматических белков и компонентов гранул нейтрофилов [4]. Следовательно, функция ДНК заключается не только в хранении и передаче генетического материала, но и в защите организма от различных экзогенных и эндогенных патогенов. Обычно этот процесс сопровождается смертью нейтрофилов.
Сравнительно недавно был описан механизм образования ловушек нейтрофилами, который не приводит их к гибели. В состав таких экстрацеллюлярных ловушек входила митохондриальная ДНК [5].
Чаще всего NETоз происходит при участии активных форм кислорода (АФК) – это так называемый АФК-зависимый NETоз. Интенсивность образования нейтрофильных внеклеточных ловушек зависит от генерации АФК и активности НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы [6].
АФК также образуются и в ходе деградации пуриновых метаболитов. Одной из таких реакций является окисление гипоксантина и ксантина в присутствии ксантиноксидазы. Ксантиноксидаза – ведущий прооксидантный фермент. Литературных данных о повреждающем воздействии АФК на ДНК много [1–4, 6]. А роль прооксидантных ферментных систем в механизмах NETоза выяснена недостаточно.
Цель исследования: изучить профиль ксантиноксидазы (КО) и ксантиндегидрогеназы (КДГ) в плазме крови и циркулирующих лимфоцитах у больных РА серонегативных и серопозитивных по ревматоидному фактору.
Материалы и методы исследования
В исследование были включены 75 (52 женщины и 23 мужчины) больных РА и 35 практически здоровых людей. Отбор больных проводился в ревматологическом отделении ГКБ СМП № 25 г. Волгограда. Диагноз устанавливался на основе критериев, рекомендованных ACR/EULAR 2010 [7]. Средний возраст больных составил 43,9 ± 0,97 лет, средняя продолжительность заболевания – 8,5 ± 0,3 лет. Степень активности ревматоидного процесса определялась с использованием индекса DAS 28. I (минимальная) степень установлена у 15 (20 %), II (умеренная) – у 49 (65,3 %) и III (максимальная) – у 11 (14,7 %) больных. Первая рентгенологическая стадия поражения суставов по Штейнброкеру определялась у 8 (9,7 %), II – у 53 (57,6 %), III – у 25 (27,2 %), IV – 6 (6,5 %) больных. У всех больных наблюдалось ограничение функциональных возможностей суставов: I функциональный класс (ФК-1) установлен у 30 (40 %) больных, ФК-2 – у 40 (53,3 %) и ФК-3 – у 5 (6,7 %) больных. Серопозитивная форма РА наблюдалась у 49 (65,3 %) больных, серонегативная – у 26 (34,7 %). Суставная форма обнаружена у 44 (58 %) больных РА. У 31 (41,3 %) больного выявлены системные поражения. Из внесуставных поражений наиболее часто диагностировалась патология мышц (31,3 %), сердца (27,5 %), желудочно-кишечного тракта (26,3 %), почек (13,8 %).
Комплексное медикаментозное лечение больных РА включало нестероидные противовоспалительные средства: индометацин, диклофенак, мовалис, кетопрофен, мелоксикам, напроксен, целекоксиб и др.; базисную терапию: метотрексат, сульфасалазин, инфликсимаб, лефлуномид, гидроксихлорохин; глюкокортикоиды. Лечение проводилось с учетом клинических особенностей заболевания, степени активности процесса, характера течения, внесуставных поражений.
Объектами исследований служили плазма и лизаты лимфоцитов периферической крови здоровых лиц и больных РА. Лимфоциты из венозной крови выделяли по методике Boyum методом дифференциального центрифугирования с использованием лимфосепа (Lympho separation medium) фирмы «JCN Biomedicals» в градиенте плотности 1,077–1,079 г/мл [8]. Лизаты клеток готовили путем трехкратного замораживания-оттаивания с последующим центрифугированием. Активность ксантиноксидазы (КО; Е.С. 1.17.3.2) и ксантиндегидрогеназы (КДГ; Е.С. 1.17.1.4) в плазме и лизатах лимфоцитов определяли спектрофотометрическим методом по ранее опубликованным методикам и выражали в нмоль/мин/мл [9]. Для лизатов лимфоцитов активность приводили к содержанию клеток 1×107 на 1 мл.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного пакета Statistica 6.0. Результаты выражали как среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (М ± m). Подбор критериев для сравнения групп осуществляли по общепринятым правилам. Достоверными различия считались при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Обследовано 35 практически здоровых людей в возрасте от 18 до 55 лет, среди которых было 24 (68,6 %) женщин и 11 (31,4 %) мужчин; средний возраст – 37,2 ± 2,18 лет. Существенной зависимости активности энзимов от пола и возраста выявлено не было, что позволило в дальнейших исследованиях эти факторы не учитывать. Референтные пределы активности ферментов представлены в табл. 1.
Таблица 1
Референтные пределы активности ферментов в плазме крови и лизатах лимфоцитов
|
Фермент |
Референтные пределы (М ± 2σ), нмоль/мин/мл |
|
|
Плазма |
Лимфоциты |
|
|
КО |
2,60–3,96 |
14,2–27,8 |
|
КДГ |
4,49–5,93 |
22,5–40,7 |
У больных РА (группа в целом) по сравнению с референтной группой (табл. 2) в плазме выявлено повышение активности КО, незначительное снижение активности КДГ; в лизатах лимфоцитов – снижение активности КО, КДГ. В своих более ранних работах нами была обнаружена зависимость активности КО и КДГ от активности патологического процесса [10, 11]. Поскольку РФ выполняет роль индикатора воспалительного процесса и аутоиммунных нарушений, мы предположили, что наличие РФ может также оказывать влияние на энзимный профиль крови.
Таблица 2
Активность ферментов в плазме крови и лимфоцитах у больных РА
|
Энзим |
Здоровые, n = 35 |
Больные РА |
||
|
Группа в целом, n = 75 |
Серопозитивная форма, n = 49 |
Серонегативная форма, n = 26 |
||
|
КО в плазме |
3,28 ± 0,062 |
5,74 ± 0,102 |
6,17 ± 0,112,* |
5,46 ± 0,122,* |
|
КДГ в плазме |
5,21 ± 0,061,2 |
4,99 ± 0,083 |
5,47 ± 0,091,* |
4,65 ± 0,082,* |
|
КО в лимфоцитах |
21 ± 0,592 |
11,2 ± 0,302 |
10,0 ± 0,312,* |
12,0 ± 0,412,* |
|
КДГ в лимфоцитах |
31,6 ± 0,802 |
15,6 ± 0,362 |
14,0 ± 0,462,* |
16,7 ± 0,452,* |
Примечание. 1р < 0,05. 2р ˂ 0,001. 3p > 0,05. Непарный критерий Стьюдента.
*р < 0,001. Парный критерий Стьюдента.
У больных РА с серопозитивной формой по сравнению с контрольной группой (табл. 2) в плазме выше активность КО и КДГ, в лимфоцитах активность КО и КДГ ниже. У больных РА с серонегативной формой (табл. 2) в плазме крови выше активность КО, но ниже активность КДГ, а в лимфоцитах активность обоих ферментов снижена.
Сравнение этих двух форм РА показало, что у больных с серопозитивной по сравнению с серонегативной формой (табл. 2) в плазме выше активность КО, КДГ, в лимфоцитах ниже активность КО и КДГ.
Таким образом, проведенные нами исследования выявили зависимость изученных энзимных показателей от наличия или отсутствия РФ. Показано, что у больных с серопозитивной формой РА активность КО в плазме крови повышена в большей степени, чем при серонегативном варианте, а активность КДГ, сниженная при серонегативной форме РА, повышается у больных с серопозитивным РА. В лизатах лимфоцитов активность КО и КДГ снижена и при серопозитивной, и при серонегативной формах РА, но наиболее выраженные изменения активности энзимов обнаружены у больных РА с серопозитивной формой. КО и КДГ – две взаимопревращающиеся формы ксантиноксидоредуктазы. Уникальный ферментный комплекс ксантиноксидаза/ксантиндегидрогеназа является одной из главных систем генерирования активных форм кислорода в организме. Трансформация фермента в кислород-зависимую форму – КО запускается разными механизмами [12]. Активация КО-реакции приводит к генерации супероксидных радикалов, которые оказывают токсическое воздействие на хроматин и белки ядра клетки и запускают генетически запрограммированную гибель клеток – апоптоз [13]. Кроме того, в условиях дефицита NAD+, возникающего при воспалении, КДГ также может генерировать супероксид, еще до трансформации КДГ в КО [14]. По мнению исследователей, важную роль в модуляции клеточного баланса между КДГ и КО играет НАДФН-оксидаза. АФК, продуцируемые НАДФН-оксидазой, стимулируют превращение ксантиноксидоредуктазы из ее дегидрогеназной формы (КДГ) в оксидазную (КО) [15].
По данным современных научных исследований, наряду с интерлейкинами и липополисахаридами, образование нейтрофильных внеклеточных ловушек провоцирует и РФ [2].
Таким образом, исходя из полученных нами данных, мы можем предположить, что в развитии и прогрессировании аутоиммунного процесса при РА активное участие принимают прооксидантные энзимные системы, что не противоречит и литературным данным.
В настоящее время все еще остается непонятным механизм переключения между различными эффекторными программами лейкоцитов. Высказывается предположение, что NETоз является резервным механизмом в программе активной контролируемой клеточной гибели нейтрофилов и запускается после неудачного фагоцитоза, апоптоза [4].
Лечение РА препаратами нового поколения позволяет контролировать течение заболевания и значительно улучшить качество жизни больных. Но, несмотря на успехи в этом направлении, достигнуть необходимого терапевтического результата удается не всегда. Вероятно, это связано с тем, что не все патогенетические механизмы, поддерживающие воспалительный процесс, выяснены на данный момент. Дальнейшее изучение патогенетических путей и создание новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов, направленных на блокирование патологических реакций, остается актуальной задачей современной медицины.
Выводы
1. Для энзимного профиля больных РА характерно повышение активности КО в плазме крови и снижение активности КО и КДГ в лимфоцитах.
2. Наиболее выраженные изменения активности энзимов обнаружены у больных РА с серопозитивной формой.