Костная ткань обладает способностью к регенерации, однако в ряде случаев при потере больших объемов кости, остеопорозе, после резекции опухолевых образований восстановление костных дефектов естественным путем весьма затруднено, если вообще возможно [1]. Чтобы восстановить крупные костные дефекты, используют костные трансплантаты. Известно, что только в Соединенных Штатах Америки ежегодно регистрируется в среднем 15 миллионов пациентов с переломами костей, из которых в 1,6 миллиона случаев требуется применение костных трансплантатов при лечении [2]. Примерное соотношение наблюдается во всем мире, так что спрос на костные трансплантаты велик и, скорее всего, он будет увеличиваться.
В настоящее время для замещения костных дефектов применяются следующие материалы:
– природного происхождения: аутокость (фрагмент кости пациента), аллокость (фрагмент трупной кости человека), ксенокость (фрагменты костей животных), фитогенные материалы, получаемые из водорослей (фосфаты кальция), фрагменты кораллов (карбонатные системы), шелк;
– искусственного происхождения: различные типы керамики, биологически активное стекло, трикальцийфосфат, гидроксиаппатит, никелид титана, а также органические полимеры, такие как полиметилметакрилат, полилактиды, полигликолиды и их сополимеры, поликапролактон, полиуретан, поликарбонат и другие;
– композитные материалы, например, синтетические полимеры с включением керамики;
– костнопластические материалы в комбинации с ростовыми природными или рекомбинантными факторами, например костными морфогенетическими белками, факторами роста.
Следует отметить, что костно-пластические материалы также могут классифицироваться по их влиянию на окружающие клетки и ткани – остеогенности (способность формировать неокость), остеоиндуктивности (способность вызывать остеогенную дифференцировку клеток – предшественников) и остеокондуктивности (способность вызывать соединение фрагментов кости) [3].
На настоящий момент аутологичные костные трансплантаты считаются «золотым стандартом» для восстановления костной ткани. Тем не менее это не может решить проблему регенерации в случаях, связанных с потерей больших объемов костной массы. Кроме того, при данном виде трансплантации организму пациента также требуется восстанавливать «донорский участок» [4], что тяжело переносится пациентами пожилого возраста и не всегда приводит к положительному результату лечения.
Аллогенные костные трансплантаты можно использовать в качестве альтернативы аутологичным, но они представляют потенциальный риск иммунного отторжения и патогенной трансмиссии [5]. Кроме того, небольшое число доноров и этические проблемы при использовании трупного материала ограничивают клинический спрос на этот вид трансплантатов. Учитывая эти обстоятельства, необходимость разработки эффективных и надежных костных трансплантатов очевидна. Последние разработки в области тканевой инженерии, направленные на создание искусственной функциональной ткани, способствуют созданию кости in vitro [6].
Тканевая инженерия в настоящее время является одной из самых многообещающих технологий восстановления поврежденных органов и тканей. Основной задачей тканевой инженерии является создание структурно-функциональных имитаций биологических тканей, трехмерная структура которых соответствует поврежденным тканям реципиента. В наиболее приближенном варианте это специализированные клетки, помещенные на/в скаффолды. Скаффолды, или матрицы, представляют из себя трехмерные пористые или волокнистые структуры, основная функция которых состоит в обеспечении механического каркаса для клеток [1, 7], а также оптимальных условий для метаболизма и дифференцировки клеток, возможностей для неоваскуляризации и ремоделирования регенерирующей ткани [8]. В инженерии костной ткани скаффолд должен имитировать внеклеточный матрикс кости, выполняя аналогичные функции [1, 9, 10]. Помимо этого, материал скаффолда должен позволять модификации биомеханических свойств импланта (эластичность, прочность) [9], что очень важно в тканевой инженерии костной ткани.
В последнее время был достигнут определенный прогресс в инженерии костной ткани. В частности, был достигнут успех в поиске источников клеток для тканеинженерных конструкций, разработке биосовместимых и биодеградируемых скаффолдов, дизайне биореакторов для эффективного культивирования и заселения матриц остео- генными клетками, а также в выявлении факторов роста, которые могут инициировать формирование эндогенной кости и/или способствовать ее васкуляризации [11]. Многочисленные доклинические испытания с различными животными моделями продемонстрировали хорошие результаты [12]. Однако для внедрения в клиническую практику необходимо решение ряда вопросов: подбор оптимальных источников клеток, выбор материала для создания скаффолда, создание конструкции с клетками in vitro и метод оперативной доставки конструкции в место дефекта.
В последние несколько десятилетий активно исследуются стволовые клетки, как для получения in vitro костных клеток, так и регенерации костной ткани в естественных условиях. Были предложены две гипотезы для объяснения механизма регенерации кости стволовыми клетками. В традиционном подходе остеогенные стволовые клетки / клетки-предшественники участвуют в образовании новой костной ткани путем непосредственной дифференцировки в функциональную ткань. Совсем недавно установлено, что факторы, секретируемые стволовыми / клетками-предшественниками, могут способствовать регенерации функциональной ткани [13]. Много усилий в настоящее время сосредоточено на поиске источников стволовых клеток, условий их культивирования для клинических испытаний. Стволовые клетки представляют особый интерес в регенеративной медицине, так как обладают рядом характеристик, которые отличают их от других типов клеток. Стволовые клетки представляют собой неспециализированные полипотентные клетки, которые способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков, различные типы взрослых клеток и представляют собой единственный тип клеток, который имеет возможность делиться до бесконечности. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой клетки с ограниченной потентностью и характеризуются следующими параметрами: 1) экспрессируют клеточные поверхностные маркеры, которые не являются гемопоэтическими или неэндотелиальными, а также ряд других маркеров клеточной поверхности, в том числе CD73, CD105 и CD90, и 2) способностью к дифференцировке в трех направлениях: остеоциты, хондроциты и адипоциты [14]. Существует три источника МСК: костный мозг, жировая ткань и надкостница [15]. МСК, выделенные из костного мозга (КМ-MСК) широко используются как для аутологичных, так и для аллогенных трансплантаций. КМ-MСК легко размножаются в культуре и дифференцируются в остеоциты при использовании специальных дифференцировочных сред. В тканевой инженерии КМ-MСК используются для создания костного импланта путем заселения их в соответствующие скаффолды [16]. Однако выделенные из тканей взрослых пациентов КМ-MСК продемонстрировали относительно низкую эффективность при остеогенной дифференцировке в естественных условиях в нескольких сравнительных исследованиях [17, 18]. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из ткани надкостницы, показали лучшую способность к минерализации и неоваскуляризации, чем выделенные из костного мозга взрослых пациентов MСК, и демонстрировали хорошую эффективность в репарации модели дефекта свода черепа. Тем не менее потенциал этих клеток ограничен небольшим объемом надкостницы, а также сложностью процесса выделения [19].
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и взрослые мезенхимальные стволовые клетки (MСК) являются основными типами стволовых клеток, используемых для инженерии костной ткани. ЭСК обладают абсолютной плюрипотентностью, поэтому они могут генерировать типы клеток из всех трех зародышевых слоев: энтодермы, эктодермы и мезодермы. Однако многие факторы, включая этические проблемы, иммунологическую несовместимость, потенциал развития злокачественных опухолей, гетерогенную дифференцировку, недостаточное понимание и слабый контроль направленной дифференцировки, ограничивают применение ЭСК и МСК [20].
Создание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) открыло новые источники клеток для инженерии костной ткани [21]. Тем не менее получение ИПСК является сложным и малоэффективным процессом. Кроме того, необходим точный контроль процесса дифференцировки перед внедрением в клиническую практику. Это особенно актуально, так как наличие недифференцированных клеток может привести к образованию тератомы после трансплантации [22].
Разработка скаффолдов является одним из основных аспектов при конструировании костных трансплантатов. С одной стороны, эти скаффолды должны быть жесткими и устойчивыми к внешним воздействиям, поскольку они функционируют как основная опорная конструкция костного трансплантата. С другой стороны, они должны быть пористыми, биосовместимыми, остеоиндуктивными и остеокондуктивными [23]. Кроме того, они должны обладать относительно низкой скоростью деградации, что имеет решающее значение для обеспечения механической поддержки до полной регенерации костного дефекта. Скаффолды могут быть изготовлены из естественных, искусственных и композитных материалов, объединяющих первые и вторые.
Природные материалы, применяемые для инженерии костной ткани, включают в себя биологические полимеры и неорганические материалы. Наиболее часто используемыми биологическими полимерами для инженерии скаффолдов являются коллаген, хитозан, эластин, целлюлоза, гиалуроновая кислота, альгинат, фибрин, желатин и т.д. Для примера, хитозан представляет собой гидрофильный линейный полисахарид, полученный щелочным деацетилированием хитина ракообразных. Он обладает многими полезными свойствами, такими как: биосовместимость (отсутствие воспалительной или аллергической реакции), биоразлагаемость (естественно разлагается гидролитическими ферментами, такими как лизоцим) и нетоксичность (не выделяет токсических веществ при деградации) [24]. Природные материалы являются предпочтительными, поскольку обладают естественными биологическими сигналами, которые способствуют адгезии клеток и способствуют хемотаксисной реакции при имплантации in vivo [25]. При использовании в качестве трансплантатов эти полимеры легко перестраиваются клетками реципиента. Кроме того, волокнистые свойства полимеров позволяют регулировать структуру и пористость во время изготовления скаффолдов [26].
Наиболее распространенным белком в различных тканях, включая кость, является коллаген. Скаффолды из коллагена очень привлекательны для создания биоинжинерных конструкций, поскольку его механические свойства могут быть изменены путем сшивания с различными химическими агентами (глутаровый альдегид, формальдегид и т. д.), либо при их физической обработке (УФ-облучение, нагрев и т.д.) [28, 29]. Гиалуроновая кислота представляет собой простой линейный полисахарид, состоящий из повторяющегося дисахарида, который является гидрофильным, неиммуногенным, он легко модифицируется и синтезируется. Скаффолды из гиалуроновой кислоты заменяются внеклеточным матриксом, продуцируемым клетками реципиента при воздействии гиалуронидазы. Данные природные материалы имеют огромную биологическую активность: способствуют клеточной адгезии, а также росту клеток. Они являются биоразлагаемыми, позволяя клеткам реципиента заменять искусственный каркас собственным внеклеточным матриксом. Основными недостатками из натуральных биологических полимеров являются механопрочностные характеристики, ограничивающие их использование в качестве костных трансплантатов. Ограниченная физическая и механическая стабильность, а также высокая скорость деградации ограничивают применение скаффолдов из биодеградируемых материалов для восстановления костной ткани. Основные минералы кости (гидроксиапатит и трифосфат кальция) так же являются перспективными кандидатами для создания скаффолдов. Их механические свойства могли бы обеспечить механическую поддержку в области дефекта после трансплантации, но эти вещества являются по своей природе хрупкими, что не позволяет эффективно противостоять внешнему воздействию. В настоящее время они используются, как правило, в сочетании с полимерными материалами с более высокой вязкостью для достижения оптимизированных свойств в месте имплантации [30].
По сравнению с природными, искусственные материалы могут быть разработаны и произведены с заданными химическими и физическими свойствами. Использование искусственных материалов позволяет управлять механическими свойствами скаффолдов, в том числе прочностью на разрыв, устойчивостью к истиранию и скоростью деградации, а также адаптировать желаемые биологические свойства, такие как снижение риска токсичности, иммуногенности и инфицирования [31]. Искусственные материалы, однако, не имеют биоактивных свойств, таких как биосовместимость, остеоиндуктивность, остеокондуктивность, что обуславливает необходимость модификации этих материалов перед использованием.
При изготовлении костных трансплантатов используют две отдельные группы синтетических биоматериалов: керамика и синтетические полимеры. Керамические полимеры (неорганические оксиды и соли), такие как гидроксиапатит (HA), β-трикальцийфосфат (β-TCP) и двухфазный фосфат кальция (BCP) механически жесткие, что делает их пригодными для трансплантации в дефекты костной ткани. Керамика имитирует естественную структуру костей, а взаимодействие клеток с керамикой способствует пролиферации и дифференцировке МСК в остеобласты [32]. Особый интерес представляют скаффолды, содержащие в своем составе фосфаты кальция, гидроксиапатиты, β-трикальцийфосфаты, поскольку они имитируют химическую и кристаллическую природу минеральной фазы нативной кости [32], и, следовательно, они будут биосовместимыми. Последние исследования продемонстрировали, что добавлением легирующих добавок в такие скаффолы можно контролировать биосовместимость, скорость деградации и механическую прочность [34]. Такие конструкции были определены как биоактивные стекла, силикатные биоактивные стекла, боратные биоактивные стекла, фосфатные биоактивные стекла и акерманит. Было показано, что легированные биологические стекла с различными элементами в качестве легирующей добавки, такими как Cu, Zn и Sr, способствуют росту костной ткани [35]. Эти биостекла продемонстрировали усиление процесса ангиогенеза и заживления ран мягких тканей. И эта способность биостекло может быть применена на практике как альтернативный подход к использованию дорогостоящих факторов роста для стимуляции неоваскуляризации тканеинженерных конструкций [36].
Искусственные полимеры, такие как полистирол, полигликолевая кислота (PGA) и поли-1-молочная кислота (PLLA), обладают необходимыми свойствами: их пространственная структура может корректироваться в зависимости от состава полимера. Однако при заселении клетками конструкций из таких материалов наблюдается плохая клеточная адгезия и пролиферация. Это происходит потому, что данные синтетические полимеры при гидролизе понижают локальный рН, чем могут вызвать некроз клеток [37]. Поскольку керамика обладает превосходными остеоиндуктивными свойствами, но имеет повышенную хрупкость, а синтетические полимеры проявляют низкую остеоиндуктивность, но обладают лучшей механической прочностью, эластичностью и разлагаемостью, то учитывая все эти факты, исследователи пытаются разработать в последнее время каркасы из керамических и полимерных композитов. Наиболее часто используемые трехмерные композиты изготавливаются из искусственных полимеров, таких как поли-молочная кислота (PLA), PGA, поли-ε-капролактон (PCL), поли-лактид-ко-гликолид (PLGA), полипропиленфумарат, (PPF) и природных полимеров, таких как коллаген I типа и хитозан. Эти композиты имеют жесткие губчатые структуры, часто содержат гидроксиапатит, усиливающий адгезию МСК, дифференцировку в остеогенном направлении, и способствуют выживанию клеток [38] на скаффолдах.
Много работ посвящено стратегии улучшения процесса васкуляризации в области трансплантации искусственных конструкций, так как это является важным фактором в обеспечении выживания трансплантата и, следовательно, восстановления костной ткани [39, 40]. Слабый ангиогенез является основной проблемой в тканевой инженерии [41]. В настоящее время существуют различные стратегии, которые направлены на улучшение васкуляризации трансплантатов. К ним относятся: индукция васкуляризации в естественных условиях, дизайн скаффолдов, а также методы преваскуляризации с использованием систем со-культивирования [40–42].
В последнее время разрабатываются новые подходы, синтез скаффолдов с клетками в условиях 3D-системы. Некоторые из них были введены в клиническое применение. Основное преимущество этой системы заключается в том, что 3D-среда наиболее естественна для клеток костной ткани. Для создания «живого» скаффолда, обеспечивающего механическую поддержку и биологически активные сигналы для клеток с остеогенным потенциалом, исследователи разработали биореакторы для имитации естественных физиологических условий. Главным преимуществом является то, что эта система позволяет управлять всеми переменными. В отличие от классических статичных культур in vitro, биореакторы позволяют применять механическое воздействие на клетки, которое очень важно при остеогенной дифференцировке [43]. Были исследованы различные модели биореакторов [44, 45]. Недавно разработанные перфузионные биореакторы показали, что использование перистальтических насосов позволяет добиться улучшения таких параметров, как клеточная пролиферация, подача питательных веществ по всему скаффолду, а также усиление остеогенной дифференцировки [45].
Еще одним новым направлением в разработке «живых» скаффолдов является создание градиентных ячеистых скаффолдов. Ячеистые структуры с градуированными размерами пор и уровнем пористости могут имитировать градуированную структуру костной ткани [46]. Преимущество градиентных ячеистых структур над равномерными ячеистыми структурами состоит в том, что первые обеспечивают более реальную среду, для обеспечения биологических и механических функций. Для ортопедических применений, связанных с разделением напряжений, осевая градуированная ячеистая структура продемонстрировала сбалансированные механические характеристики [47]. Предполагается, что использование в качестве импланта градуированных ячеистых структур позволит улучшить распределение нагрузки в соседних тканях, повысит остеоинтеграцию с костной тканью реципиента и обеспечит оптимальную проницаемость питательных веществ [48].
Заключение
Ежегодно для лечения тяжелых форм переломов костей требуется большое количество костных трансплантатов. Ограничения применения в клинике аутотрансплантатов и аллотрансплантатов инициировали развитие новых альтернативных методов тканевой инженерии, которые может предложить новое решение для производства костных трансплантатов для клинического применения. В последние годы в разработке имитаций костной ткани были достигнуты значительные успехи, хотя проблема перевода этих разработок в клиническое применение до сих пор не решена. Широко исследуются различные типы стволовых клеток для формирования минерализованной костной ткани in vitro. В противоположность этому, гораздо меньше число исследований сосредоточено на оценке эффективности дифференцировки стволовых клеток и её возможных побочных эффектов. Одним из основных препятствий для нормальной интеграции трансплантата является сложный процесс взаимодействия с микроокружением реципиентного ложа. Это особенно актуально для аллогенных клеток, где иммунная реакция реципиента, вероятно, играет очень важную роль. Применение биоматериалов для скаффолдов важно при создании костных имплантов, поскольку они способны обеспечивать механическую поддержку во время восстановления костной ткани. Для получения оптимальных механических свойств с высокой степенью биосовместимости были разработаны многочисленные композиционные материалы из различных компонентов.
Идеальный трансплантат трудно получить. Он должен быть биосовместимым, биорезорбируемым, остеокондуктивным (должен способствовать клеточной адгезии, пролиферации и секретированию внеклеточного матрикса), остеоиндуктивным (индуцировать образование костей), остеогенным (стимулировать дифференцировку клеток в остеогенном направлении), обладать структурой, сходной со структурой костной ткани, что позволяет формировать прочные связи с ложем реципиента. Значительным недостатком тканеинженерных конструкций является проблема равномерного заселения, миграции и размещения клеток в объеме матрицы и отсутствие биодеградации вещества матрицы. Так как от равномерного распределения клеток в объеме матрицы зависит их способность к адгезии, пролиферации, последующей дифференцировке и синтетической активности. На настоящий момент известно, что геометрия поверхности, размеры пор в матрице могут оказывать влияние на клеточную пролиферацию, остеогенную индукцию и остеокондуктивные свойства, что реализуется через межклеточные взаимодействия.
Таким образом, несмотря на то, что на протяжении ряда последних лет ведется активный поиск решения проблемы замещения костных дефектов, возникших при различных патологических состояниях, в настоящее время идеальной стратегии так и не получено, а для клинического использования зарегистрировано всего несколько трансплантатов.