Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,593

1
1

Разработана кинетическая модель экспресс-тестирования антиоксидантной активности (АОА) различных классов органических соединений в условиях, приближенных к условиям биологической среды. Показано, что скорость окисления модельных липидов в водно-эмульсионной среде в 1000 раз выше, чем в безводной среде. Подобраны оптимальные условия каталитического окисления эфиров высших ненасыщенных жирных кислот в водно-эмульсионной среде в зависимости от природы и концентрации солей металлов переходной валентности и поверхностно-активного вещества. Исследована АОА важнейших органических ингибиторов в сравнении со стандартными антиоксидантами дибунолом и a-токоферолом в водно-липидных катализируемых субстратах.

В связи с широким внедрением ингибиторов окисления, актуальной является проблема предварительного тестирования их антиоксидантной активности. Поскольку большинство известных моделей для тестирования антиоксидантов являются гидрофобными, представлялось актуальным подобрать гидрофильную липидную систему и проверить её эффективность на примере известных химических соединений, предположительно имеющих антиоксидантную активность, сравнить их действие с реперными ингибиторами окисления. Известны многочисленные работы по тестированию активности катионов металлов, которые относятся, в основном, к катализу гомогенных липидных систем [1, 2, 3, 4]. Эти результаты имеют ограниченное значение для описания процессов окисления, протекающих в мицеллах и живой клетке. Мало работ, в которых сравниваются антиоксидантные свойства соединений различных классов в безводной и водно-эмульсионной средах (ВЭС) в условиях инициирования и катализа.

Целью данного исследования являлась разработка кинетического способа тестирования антиоксидантной активности различных классов органических соединений (фенолов, аминов, серосодержащих соединений), в условиях, приближенных к биологическим средам, изучение антиоксидантной активности ряда полифункциональных соединений в сравнении с реперными антиоксидантами дибунолом и a-токоферолом.

Экспериментальная часть

Антиоксидантную активность (АОА) изучали манометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке типа Варбурга при окислении модельного субстрата (метиллинолеата (МЛ) и этилолеата (ЭО)) в присутствии триметилцетиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) (10–4–10–2 М), с добавками растворов солей металлов в количестве (10–6–10–1 М) при t = (60 ± 0,2) °С. Соотношение воды и эфира составляло 3:1, а общий объем пробы 4 мл [5]. Кинетику поглощения кислорода в безводной среде изучали в среде инертного растворителя хлорбензола, процесс инициировали за счет термического разложения азо-бис-изо-бутиронитрила (АИБН) в концентрации 6∙10–3 М. Графическим методом определяли величину периода индукции (ti), представляющей собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый перпендикуляром, опущенным из точки пересечения касательных, проведенных к кинетической кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного субстрата определяется совокупностью реакций ингибитора и обозначает его антиоксидантную активность, количественно определяемой по формуле АОА = ti – tS/tS, где tS и ti – периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого АО соответственно. В качестве реперных ингибиторов использовали a-токоферол (a-ТФ) и дибунол, при этом концентрации АО были сравнимыми.

Результаты и их обсуждение

Разработка кинетического метода базировалась на исследовании активности солей переходных металлов: FeSO4, FeCl3, NiCl2, CoCl2, CuCl2 в водно-липидных субстратах. С целью выбора наиболее эффективного катализатора изучали в сравнительном аспекте влияние упомянутых выше солей на процесс окисления МЛ. Более детальное изучение кинетики окисления липидных субстратов в присутствии металлов переменной валентности было показано раннее в работе [5].

Действие упомянутых выше солей было изучено в широком диапазоне концентраций для отбора среди них наиболее эффективных катализаторов. В результате исследований установлено, что аутоускоренный характер имеет кинетика окисления водно-липидных субстратов в присутствии катионов Fe2+, Co2+ и Cu2+. Характер кинетических кривых окисления липидных субстратов в зависимости от концентрации катионов позволил предполагать преобладающее участие Fe3+, Ni2+ в обрыве цепей, участие Fe2+, Co2+, Cu2+ в зарождении и разветвлении цепей. Зависимости скорости окисления метиллинолеата от концентрации солей металлов носят экстремальный характер, экстремумы проявляются в разных диапазонах. Скорости окисления липидных субстратов в присутствии солей NiCl2 и FeCl3 выходят на максимум при концентрациях 1,0∙10–3 М, далее с ростом концентрации их значение не меняется и составляет (4,0 ± 0,2)∙10–5 М∙с–1 и (5,0 ± 0,3)∙10–5М∙с–1 соответственно. Максимальная скорость при окислении с добавками сульфата железа отмечается в диапазоне (0,1–1,0) М и составляет (9,4 ± 0,4)∙10–5 М∙с–1, при дальнейшем росте концентрации – остается постоянной и составляет (6,0 ± 0,2)∙10–5 М∙с–1. Зависимость Wmax систем с добавками хлорида кобальта имеет «пик» при концентрации (9 – 11)∙10–3 М, при которой ее величина составляет (24,4 ± 0,4)∙10–5 М∙с–1. Хлорид меди по своим каталитическим свойствам выделяется среди всех исследуемых веществ. Скорость окисления в присутствии хлорида меди выше в 5 раз, чем в присутствии других солей металлов переменной валентности и при концентрации 2∙10–3 М составляет (26,3 ± 0,3)∙10–5 М∙с–1(табл. 1).

Таблица 1

Кинетические параметры окисления метиллинолеата в присутствии солей железа (II, III), никеля (II), кобальта (II) и меди (II) в ВЭС, t = 60 °С, СЦТМАБ = 1∙10–3 М, вода:липиды – 3:1

Катализатор

Fe2+

Fe3+

Ni2+

Co2+

Cu2+

Fe2+

Fe3+

Ni2+

Co2+

Cu2+

[Кат.], М

2⋅10−3

1∙10−3

Wнач∙10–5, М∙с–1

6,8

1,7

2,4

14,2

14,4

6,8

2,3

3,5

11,4

8,6

Wmax∙10–5, М∙с–1

6,1

3,5

3,2

7,3

26,3

5,9

3,2

4,1

6,8

14,5

В нашем эксперименте каталитическая активность солей металлов уменьшается в ряду: Cu2+ > Fe2+ > Fe3+ > Co2+ > Ni2+. Ранее каталитическое действие металлов переменной валентности изучалось при окислении растительных масел и модельных липидных субстратов [1, 3, 4, 6]. Был получен ряд каталитической активности: Cu2+ > Mn2+ > Fe2+ > Cr2+ > Ni2+ >> Zn2+. Как видно из приведенных выше данных изученные соли вписываются в указанный ряд активности металлов, а хлорид меди обладает наибольшей каталитической активностью при наименьшей концентрации 2∙10–3 М.

Следующим этапом создания модели для тестирования антиоксидантов был выбор концентрации ЦТМАБ. Известно [7], что скорость окисления в гомогенных системах ниже, чем в эмульсиях и зависит от степени ее дисперсности. В работе [1] установлено, что соотношение констант скорости роста и обрыва цепи при инициированном окисление кумола в эмульсиях и гомогенной системе соотносится как 5,5:1 и равно 110 и 20 соответственно.

Нами также было установлено, что скорость окисления МЛ в водно-эмульсионной среде ~ в 1000 раз выше, чем в безводной среде.

При выборе оптимальной концентрации ЦТМАБ исследовали диапазон (10-4–10−2) М. Установлено, что с ростом концентраций ПАВ скорость процесса проходит через максимум, соответствующий концентрации 1∙10−3 М. Дальнейшее повышение концентрации ЦТМАБ приводит к снижению скорости окисления. Указанную концентрацию детергента, обеспечивающую наибольшую скорость реакции, можно рекомендовать для использования в гетерогенных моделях окисления. Методом Ребиндера и рефрактометрически была определена критическая концентрация мицеллообразования ЦТМАБ (1,0 ± 0,2)∙10−3 М, что соответствовало кинетическим данным.

При низких концентрациях катионы катализатора имеют большую вероятность донорно-акцепторного взаимодействия с эфирными группами субстрата, приводящего к образованию в присутствии катализатора свободных радикалов по реакции:

Me(n+1)+ + RH + O2 → Men+ + R° + H+

Механизм действия металлов связывают с каталитическим разрушением гидропероксидов в соответствии с реакциями [1]:

ROOH + Fe3+ → RO2° + H+ + Fe2+

ROOH + Cu2+ → RO2° + H+ + Cu1+

ROOH + Fe2+→ RO2° + H+ + Fe3+

Образующиеся при этом алкоксильные и пероксильные радикалы участвуют в дальнейшем в реакциях продолжения цепей окисления. Катионы металлов могут конкурентно участвовать в обрыве цепей, что должно приводить к замедлению процесса на глубоких стадиях окисления. Замедление процесса возможно также за счет перехода катиона металла в менее активную форму.

На основе проведенных исследований была предложена новая кинетическая модель для тестирования биоантиоксидантов. Модельный субстрат содержит 2∙10−3 М хлорида меди (II), 1∙10−3 М ЦТМАБ, липиды (ЭО, МЛ) и воду, соотношение липиды-вода 1 : 3.

В настоящем работе приведены результаты исследования кинетики каталитического окисления липидного субстрата в водно-эмульсионной среде в присутствии ряда полифункциональных соединений. Ряд производных фенола составили: парацетамол, осалмид. Ряд двухатомных фенолов представляли: адреналин, метилдофа. В качестве гетероциклических производных использовались: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. В качестве аминов исследовали: новокаин, коринфар. В качестве серосодержащего соединения изучали капотен. Реперными АО послужили a-токоферол и дибунол.

В нашем исследовании показан идентичный характер кинетических кривых при окислении липидных субстратов в растворе хлорбензола в присутствии 6∙10−3 М инициатора (АИБН) и водно-эмульсионной системе в присутствии 2∙10−3 М хлорида меди при разных концентрациях дибунола. Показано, что в водно-эмульсионной среде дибунол проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период полного торможения, период аутоускорения и достижение максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются пропорционально увеличению концентрации дибунола. Наличие торможения в присутствии добавок дибунола является признаком радикально-цепного механизма процесса. По наклону прямой в координатах t, [InH] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах, получены значения 6,2∙10-8 и 6,7∙10-5 М∙с–1 в безводной и водно-эмульсионной системе соответственно. Сравнение максимальных скоростей окисления ЭО при t = (60 ± 0,2) °С в безводной и водно-эмульсионной средах равных 1,3∙10-7 и 1,4∙10-4 М∙с–1 соответствует различию скоростей инициирования ~ в 1000 раз.

Показано, что реперный биоантиоксидант a-токоферол в ВЭС проявлял слабые антиоксидантные свойства, в концентрациях свыше 1∙10−3 М промотировал процесс окисление липидных субстратов (табл. 2). Полученные результаты указывают на более сложный механизм действия a-токоферола в катализируемом субстрате. Причиной ускорения процесса может быть комплексообразование OH-группы a-токоферола с катализатором. В процессе окисления a-токоферол образует достаточно активные токофероксильные радикалы, способные участвовать в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (RH):

In• + RH → R• + InH

Поскольку известно [8, 9, 10], что в углеводородной среде увеличение АРА фенолов происходит под влиянием электронодонорных заместителей, рассмотрим полученные ряды соединений в зависимости от структуры. В соответствии с теорией, ингибиторы условно делятся на сильные и слабые. Сильные ингибиторы эффективно тормозят окисление, участвуя только в реакциях обрыва цепей. Кинетика такого процесса характеризуется периодом полного торможения, аутоускорением и достижением максимальной скорости. Слабые ингибиторы способны не только обрывать цепи, но из-за высокой активности своих радикалов, участвовать в реакциях продолжение цепей. Кинетика такого процесса характеризуется отсутствием периодом полного торможения, достаточно высокими начальными скоростями, аутоускорением на определенном уровне окисления, достижением максимальной скорости. Алкилированные в пара- и орто-положения фенолы, двухатомные фенолы считаются сильными нигибиторами. Каждая алкильная или гидроксильная группа увеличивает АОА на определенную величину. Ингибитор тем эффективнее, чем меньше полярность и больше размер заместителя в пара-положении. В связи с этим нами детально изучалась зависимость изменения периодов индукции от концентрации исследуемых АО.

Установлено, что все исследуемые концентрации осалмида уменьшали начальную и максимальную скорости окисления в 5 раз по сравнению с контролем. Высокая эффективность торможения осалмида связана с участием в реакциях обрыва цепей. Во всем диапазоне изученных концентраций парацетамол снижал начальную и максимальную скорости окисления, по сравнению с контролем в 2–5 раз, проявляя высокую АОА, уступая только осалмиду (табл. 2). Взаимосвязь между периодами индукции и концентрацией адреналина и метилдофы во всем изученном диапазоне положительная. Очевидно, что в производных пирокатехина орто-гидроксильные группы связаны комплексообразованием с солями меди. Поэтому, высокая антиоксидантная активность адреналина и метилдофы, снижение максимальной скорости окисления может свидетельствовать об участии аминов в реакциях с гидропероксидами с образованием молекулярных продуктов.

Рассмотрим ряд гетероциклических производных: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. Фентоламин относится к амино-фенолам первой группы, в присутствии которых при различных концентрациях происходит окисление мицеллярного субстрата без периода индукции и периода аутоускорения. Низкая АОА фентоламина может быть обусловлена нарушением сопряжения из-за объемного заместителя в положении 3. Показано, что при всех концентрациях эмоксипин тормозит начальные и максимальные скорости окисления. В присутствии аллопуринола и эмоксипина наблюдаются периоды индукции и периоды аутоускорения. Соединения относятся к амино-фенолам второй группы. Вероятно, в этих условиях лимитирующей является реакция разрушения амином гидропероксидов по молекулярному механизму. Зависимости периодов индукции от концентрации эмоксипина, аллопуринола и фентоламина приведены в табл. 2.

Таблица 2

Кинетические параметры окисления липидных субстратов в водно-эмульсионной среде в присутствии 2⋅10−3 М CuCl2 в зависимости от концентрации АО, t = 60°С

№ п/п

С(АО), М

τi, мин

Wнач∙10–5, М∙с–1

Wmax∙10–5, М∙с–1

1

2

3

4

5

I Парацетамол

1

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

2

1∙10-4

20

6,2

10,0

3

1∙10−3

40

2,5

3,1

4

1∙10−2

45

2,0

2,4

II Осалмид

5

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

6

1∙10-4

45

2,9

4,4

7

1∙10−3

350

0,6

2,7

8

1∙10−2

500

0,4

2,5

III Адреналин

9

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

10

1∙10-4

30

3,4

4,6

11

1∙10−3

40

2,1

4,5

12

1∙10−2

60

0,9

3,8

IV Метилдофа

13

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

14

1∙10-4

30

6,8

8,8

15

1∙10−3

35

3,4

5,1

16

1∙10−2

60

0,9

2,4

V Фентоламин

17

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

18

1∙10-4

15

7,4

13,7

19

1∙10−3

20

6,8

13,8

20

1∙10−2

55

6,1

13,4

VI Аллопуринол

21

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

22

1∙10-4

50

3,7

5,3

23

1∙10−3

70

3,5

5,5

24

1∙10−2

80

2,6

5,6

VII Эмоксипин

25

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

26

1∙10-4

40

2,1

4,3

27

1∙10−3

55

1,0

3,5

28

1∙10−2

90

0,7

2,6

Окончание табл. 2

1

2

3

4

5

VIII Новокаин

29

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

30

1∙10-4

45

6,7

9,2

31

1∙10−3

50

6,5

7,6

32

1∙10−2

70

5,7

6,8

IX Коринфар

33

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

34

1∙10-4

26

4,9

7,0

35

1∙10−3

50

3,9

5,0

36

1∙10−2

100

1,4

2,5

X Капотен

37

Контроль МЛ

5

14,4

26,3

38

1∙10-4

26

6,2

16,9

39

1∙10−3

45

3,6

17,6

40

1∙10−2

95

2,1

17,5

41

1∙10−1

395

0,6

17,4

XI Дибунол

42

Контроль ЭО

15

7,5

14,0

43

1∙10-4

140

2,1

8,7

44

5∙10-4

360

1,3

8,4

45

1∙10−3

600

1,0

8,0

XII a-Токоферол

46

Контроль МЛ

5

14,4

26,3

47

1∙10-4

35

5,2

14,3

48

1∙10−3

15

14,6

32,2

49

1∙10−2

6

15,7

34,4

50

1∙10−1

5

16,8

57,3

В качестве серосодержащего соединения в настоящей работе был изучен капотен. Показано, что все добавки капотена тормозят процесс окисления, снижая начальную и максимальную скорости (табл. 2). Вероятно, капотен (R1–SH) участвует в реакциях обрыва цепей, обеспечивая ингибирования процесса окисления, снижение скорости окисления обусловлено его конкурентным участием с катализатором в распаде гидропероксидов по молекулярному механизму, что влияет на снижение скорости разветвления цепей и скорости процесса в целом:

RO2°+ R1–SH → ROOH +R1–S°

ROOH + R1–S–R2 → R1–SO–R2 + ROH

ROOH + Cu2+ → RO2°+ H+ + Cu1+

Выводы

1. Разработана кинетическая модель тестирования биоантиоксидантов в водно-эмульсионной каталитической среде, выбраны оптимальные концентрации катализатора и поверхностно-активного вещества.

2. Получен ряд каталитической активности солей металлов переменной валентности: Cu2+ > Fe2+ > Fe3+ > Co2+ > Ni2+.

3. Показан идентичный механизм действия стационарного антиоксиданта дибунола при окислении безводных и водно-эмульсионных липидных субстратов.

4. Получен ряд увеличения антиоксидантной активности полифункциональных соединений: фентоламин < новокаин < аллопуринол < парацетамол < коринфар < адреналин < метилдофа < эмоксипин < капотен < осалмид < дибунол.

По результатам тестирования антиоксидантной активности ряда ингибиторов окисления было выявлено наиболее эффективное соединение – осалмид. В Новосибирском институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН на базе структуры осалмида была синтезирована группа замещенных амидов и сульфидов салициловой кислоты, имеющих в орто- и пара-положении экранирующие трет-бутильные заместители. Сравнительному тестированию ингибирующих свойств новых перспективных соединений с целью выявления среди них активных антиоксидантов будет посвящена отдельная работа.