Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,593

1
1

Исследована антиоксидантная активность капотена(1-[(2S)]-3-меркапто-2-метил-пропионил]-L-пролина) в сравнении со стандартными антиоксидантами дибунолом (ионолом) и a-токоферолом в безводных инициированных и водно-липидных катализируемых субстратах. Установлена высокая антиоксидантная активность капотена в водно-эмульсионной среде. Показано участие капотена в процессе разрушения гидропероксидов молекулярным путем.

В настоящее время развитие гипертонической и ишемической болезней связывают с изменением интенсивности свободно-радикального окисления липидов биомембран [1, 2, 3]. Поэтому, при сердечно-сосудистой патологии применяют антиоксидантотерапию. В связи с этим, актуальной является проблема предварительного тестирования антиоксидантных свойств гипотензивных препаратов.

Целью работы являлось тестирование антиоксидантной активности капотенапри различных способах инициирования в безводных и водно-эмульсионных средах в сравнении с реперными антиоксидантами дибунолом и a-токоферолом.

Экспериментальная часть

Антиоксидантную активность (АОА) изучали манометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке типа Варбурга при окислении метиллинолеата (МЛ) в присутствии триметилцетиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) при концентрации 1∙10−3 М, с добавками растворов хлорида меди (II) в количестве 2∙10−3 М при t = (60 ± 0,2) °С. Соотношение воды и эфира составляло 3:1, а общий объем пробы 4 мл [4, 5]. Кинетику поглощения кислорода в безводной среде изучали в среде инертного растворителя хлорбензола, процесс инициировали за счет термического разложения азо-бис-изо-бутиронитрила (АИБН) в концентрации 6∙10–3 М. В качестве критериев оценки антиоксидантных свойств соединений использовали – периоды индукции, начальные и максимальные скорости окисления. Графическим методом определяли величину периода индукции (ti), представляющей собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый перпендикуляром, опущенным из точки пересечения касательных, проведенных к кинетической кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного субстрата определяется совокупностью реакций ингибитора и обозначает его антиоксидантную активность, количественно определяемой по формуле АОА = ti – tS/tS, где tS и ti – периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого антиоксиданта (АО) соответственно. Кинетику накопления гидропероксидов изучали при аутоокисленииметилолеата (МО) методом обратного йодометрического титрования в среде хлорбензола при t = (60 ± 0,2) °С. В качестве реперных ингибиторов использовали a-токоферол (a-ТФ) и дибунол, при этом концентрации АО были сравнимыми. Критическую концентрацию мицеллообразования ЦТМАБ изучали методамиРебиндера и рефрактометрическим.

Результаты и их обсуждение

Капотен представляет собой 1-[(2S)]-3-меркапто-2-метил-пропионил]-L-пролин и является тиолом. Препаратприменяют при лечении легкой и умеренной гипертонии, а также при тяжелых формах сердечно-сосудистых заболеваний. Химическая структура капотена позволяет прогнозировать его ингибирующую активность за счет восстановления гидропероксидовмеркаптогруппой или хелатирования катализатора.Впервые антиоксидантные свойства капотена были показаны в нашей работе [6]. Представляло интерес исследовать антиоксидантную активность капотена в процессе окисления метиллинолеата в условиях инициирования в среде хлорбензола и катализа в водно-эмульсионной среде.

Была изучена кинетика окисления МЛ в растворе хлорбензола в присутствии широкого диапазона концентрацийкапотена (1∙10-6–1∙10−1) М. Показано, что капотен в безводной среде проявляет сложный механизм действия, обусловленный его вероятнымучастием в реакциях обрыва, продолжения и зарождения цепей. Влияние капотена заключается в том, что при одних концентрациях происходит уменьшение максимальной скорости, при других – наблюдается промотирование процесса окисления. Из табл. 1. видно, что начальные и максимальные скорости процесса меняются экстремально: снижаются с увеличением концентрации до 1∙10-4 М (соответствует соотношению инициатора и капотена 60:1) и увеличиваются при дальнейшем её повышении.

Таблица 1

Кинетические параметры окисления метиллинолеата в безводной среде в присутствии 6∙10−3 М АИБН в зависимости от концентрации капотена, t = 60 °С

№ п/п

[InH], М∙с

t, мин

Wнач∙10–8, М∙с–1

Wmax∙10–7, М∙с

[АИБН]

[InH]

1

Контроль МЛ

20

6,0

2,2

2

1∙10-6

42

5,0

1,9

6000:1

3

5∙10-6

36

4,7

1,8

1200:1

4

5∙10-5

90

4,5

1,7

120:1

5

1∙10-4

44

4,5

1,7

60:1

6

5∙10-4

36

4,9

2,0

12:1

7

1∙10−3

20

6,0

2,2

6:1

8

1∙10−2

30

7,2

2,4

1:1,7

9

1∙10−1

22

8,0

2,8

1:17

Характер воздействия капотена на процесс инициированного окисления МЛ может быть объяснен его участием в радикальном процессе. Известно [7], что инициатор распадается с образованием радикалов по реакции:

pic_32.wmf

Радикал инициатора (Ri·) конкурентно взаимодействует с метиллинолеатом (RH) или с меркаптогруппойкапотена (R1SH) по реакциям:

Ri· + RH → RiH + R·

R1SH + Ri· → RiH + R1S·

Далее радикалы метиллинолеата (R·) и тиола (R1S·) взаимодействуют с кислородом по реакциям:

R· + O2 → RO2·

RO2· + RH → ROOH + R·

R1S· + O2 → R1SO2·

R1SO2· + R1SH → R1SO2H + R1S·

Наблюдаемое увеличение суммарной скорости процесса при высоких концентрациях тиола, вероятно, происходит за счет вклада более быстрого окисления тиола по сравнению с окислением жирно-кислотных компонентов липидов. Снижение максимальной скорости без торможения начальных стадий окисления при небольших добавках капотенаможет быть связано с участием соединения в реакциях продолжения цепей.

В сравнении была изучена кинетика каталитического окисления МЛ в водно-эмульсионной среде в присутствии (1∙10-6–1∙10−1) М капотена. Показано, что все добавки тормозят процесс окисления, хотя степень и характер влияния зависит от концентрации. Низкие концентрации капотена (1∙10-6–1∙10−3) М пропорционально уменьшают начальную и максимальную скорости процесса. При концентрациях 1∙10−3 М и выше происходит торможение начальных стадий процесса, увеличение периода индукции и достижение максимальной скорости процесса после выхода из периода индукции (табл. 2). Характер влияния капотена на кинетику каталитического окисления МЛ может быть объяснен следующим образом.Капотен может участвовать в реакциях обрыва цепей, обеспечивая ингибирования процесса окисления.Снижение скорости окисления под влиянием капотена может быть обусловлено его конкурентным участием с катализатором в молекулярном распаде гидропероксидов, что сказывается на снижении скорости разветвления цепей и скорости процесса в целом.

RO2· + R1SH → ROOH + R1S·

ROOH + R1SR2 → R1SOR2 + ROH

ROOH + Cu2+ → RO2· + H+ + Cu1+

Значимое торможение с последующим достижением максимальной скорости процесса начинается при соотношениях катализатора и капотена 1:1 и усиливается при соотношениях 1:5 и 1:50. Очевидно, что в этих условиях происходит нейтрализация катализатора за счет его восстановления в Cu+1. При большом избытке тиола восстановление Cu+2 в Cu+1 происходит быстрее, наблюдается эффективное торможение процесса окисления.

Для подтверждения гипотезы о возможном разрушении гидропероксидов под действием капотена, был проведен эксперимент по прямому тестированию кинетики накопления гидропероксидов (ROOH) после введения капотена в частично окисленный субстрат(время эксперимента 8 часов). В течение первого часа наблюдалось снижение концентрации гидропероксидов, в контрольном опыте ROOH продолжали накапливаться. Установлено, что все исследуемые добавки капотена способствовали разрушению гидропероксидов на 50–75 %.

Таблица 2

Кинетические параметры окисления метиллинолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии 2∙10−3 М CuCl2 в зависимости от концентрации капотена, t = 60 °С

№ п/п

[InH], М

t, мин

Wн∙10–5, М∙с

Wмак∙10–4, М∙с

[CuCl2]

[InH]

1

Контроль

5

14,4

2,6

2

1∙10-6

8

7,6

1,6

2000:1

3

1∙10-5

15

6,9

1,0

200:1

4

1∙10-4

26

6,2

1,6

20:1

5

1∙10−3

45

3,6

1,7

2:1

6

1∙10−2

95

2,1

1,7

1:5

7

1∙10−1

395

0,6

1,7

1:50

Сопоставление результатов двух методов (манометрического, йодометрического) показывает, что максимальное снижение начальной и максимальной скорости окисления происходило в присутствии капотена при концентрации (1–10)∙10-4 М. Таким образом, указанные методы адекватно оценивают свойства исследуемого соединения и позволяют полагать, что разрушение гидропероксидов под действием капотена осуществлялось нерадикальным путем, поскольку вторичного инициирования процесса не наблюдалось.

Таблица 3

Кинетические параметры окисления метиллинолеатав растворе хлорбензола в присутствии 6∙10–3 М АИБН в зависимости от концентрацииa-токоферола и дибунола, t = 60 °С

№ п/п

[InH], М

t, мин

Wнач∙10-8, М∙с–1

Wmax∙10–7, М∙с–1

I

Контроль МЛ

15

4,3

2,6

II

a-токоферол

1

1∙10-8

17

4,3

2,3

2

1∙10-7

20

3,6

2,0

3

1∙10-6

35

2,5

1,9

4

1∙10-5

44

2,3

1,8

5

1∙10-4

67

1,1

1,8

6

5∙10-4

120

0,5

2,0

7

1∙10−3

350

0,6

1,7

8

1∙10−2

405

0,5

1,8

9

1∙10−1

420

0,2

1,8

III

дибунол

1

1∙10-6

35

4,3

2,5

2

1∙10-5

45

3,4

2,4

3

2∙10-5

80

2,8

2,2

4

5∙10-5

140

2,4

2,2

5

1∙10-4

170

2,1

2,1

6

2∙10-4

190

1,9

2,0

7

5∙10-4

280

1,7

1,9

8

8∙10-4

590

1,6

1,9

9

1∙10−3

650

1,6

1,8

Для доказательства свободно-радикального механизма каталитического окисления липидного субстрата использован метод ингибиторов. Проведено исследование закономерностей окисления метиллинолеата в присутствии добавок стационарных ингибиторов окисления дибунола и a-токоферола. По результатам эксперимента рассчитаны кинетические параметры окисления субстратов.

В нашем исследовании показан идентичный характер кинетических кривых окисления метиллинолеата в растворе хлорбензола в присутствии 6∙10−3 М инициатора и водно-эмульсионной системе в присутствии 2∙10−3 М хлорида меди при равных концентрациях дибунола. Показано, что в водно-эмульсионной среде дибунол проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период полного торможения, период аутоускорения и достижение максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются пропорционально увеличению концентрации дибунола (табл. 3, 4). Наличие торможения в присутствии добавок дибунола является признаком радикально-цепного механизма процесса, а отсутствие комплексообразующей способности с катионами меди из-за экранированности двумя трет.бутильными заместителями его донорно-акцепторного центра.

По наклону прямой в координатах t, [InH] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах, получены значения 4,8∙10-8 и 1,9∙10‒5 М∙с–1 в безводной и водно-эмульсионной среде соответственно. Сравнение максимальных скоростей окисления МЛ в безводной и водно-эмульсионной средах равных 1,3∙10-7 и 2,6∙10-4 М∙с–1 соответствует различию скоростей инициирования ~ в 1000 раз.

Известно, что a-токоферол характеризуется чрезвычайно высокой константой скорости реакции с пероксильными радикалами k7 = (3,3–3,5)∙106 М–1∙с–1, что на два порядка превышает аналогичные константы скорости для дибунола k7 = 2,6∙104 М–1∙с–1 [8]. Между тем вопрос о роли a-токоферола в биомембранах далек от своего решения. Известен сложный механизм действия a-токоферола в безводных углеводородных и липидных субстратах, его участие не только в реакциях обрыва цепей, но и реакциях продолжения цепей и распаде гидропероксидов. Последние реакции приводят к снижению антиоксидантной активности a-токоферола. Антиоксидантную активность a-токоферола в нашем эксперименте оценивали по характеру изменения кинетических параметров по сравнению с дибунолом, для которого установлен механизм ингибирования процесса окисления в углеводородах за счет только реакций обрыва цепей [9, 10]. Анализ кинетических кривых окисления метиллинолеата показал существенные отличия механизма действия a-токоферола от дибунола в зависимости от концентрации.

Таблица 4

Кинетические параметры окисления метиллинолеата в водно-эмульсионной среде в присутствии 2∙10−3 М CuCl2 в зависимости от концентрации a-токоферола и дибунола, t = 60 °С

№ п/п

[InH], М

t, мин

Wнач∙10–5, М∙с–1

Wmax∙10–4, М∙с–1

I

Контроль МЛ

5

14,4

2,6

II

a-токоферол

1

1∙10-8

10

14,0

2,1

2

1∙10-7

15

11,0

2,1

3

1∙10-6

20

9,7

1,9

4

1∙10-5

25

6,8

1,8

5

1∙10-4

35

5,2

1,4

6

1∙10−3

15

14,6

3,2

7

1∙10−2

6

15,7

3,4

8

1∙10−1

5

16,8

5,7

III

дибунол

1

1∙10-6

30

13,8

2,5

2

1∙10-5

40

12,7

2,3

3

2∙10-5

75

9,8

2,1

4

5∙10-5

130

5,0

1,9

5

1∙10-4

160

4,1

1,8

6

2∙10-4

180

3,8

1,7

7

5∙10-4

270

3,1

1,6

8

8∙10-4

430

2,3

1,6

9

1∙10−3

590

1,9

1,5

Кинетические кривые окисления метиллинолеата в безводной среде в присутствии (1∙10-8–1∙10-5) М a-токоферола имеют аутоускоренный характер без периода полного торможения. В этом интервале концентраций начальные скорости тем меньше, чем больше добавки a-токоферола, при всех концентрациях достигается одинаковая максимальная скорость. Период полного торможения появляется только при концентрациях 1∙10-4 и 5∙10-4 М и меняется пропорционально концентрации. При дальнейшем повышении концентрации a-токоферола увеличивается начальная скорость окисления, сокращается период полного торможения, максимальная скорость достигается тем позже и при более высоких концентрациях поглощенного кислорода, чем выше концентрация a-токоферола. Результаты расчета начальной Wнач, максимальной Wmax скоростей и периода индукции приведены в табл. 3. Из табл. 3 видно сохранение близких Wmax при концентрациях a-токоферола от 1∙10-7 до 1∙10−1 М и десятикратное снижение Wнач. Представленные результаты свидетельствуют о сложном механизме действия a-ТФ в безводном растворе МЛ, об его участии не только в реакциях обрыва, но и реакциях продолжения цепей.

Было показано, что a-токоферол в ВЭС проявлял слабые антиоксидантные свойства, в концентрациях свыше 1∙10−3 М промотировал процесс окисление липидных субстратов, при концентрации1∙10-8 М a-ТФ только незначительно уменьшал максимальную скорость, без заметного влияния на начальные стадии окисления. Таким же образом влияли добавки 1∙10-7 и 1∙10-6 М a-ТФ. В присутствии 1∙10-5 и 1∙10-4 М a-ТФ наблюдалось замедление начальных стадий окисления и уменьшение максимальной скорости (табл. 4). Причиной ускорения процесса может быть комплексообразованиеOH-группы a-токоферола с катионами меди. В процессе окисления a-токоферол образует достаточно активные токофероксильные радикалы (In·), способные участвовать в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (RH) [8]:

In· + RH → R· + InH

В результате этой реакции восстанавливается активная фенольная форма антиоксиданта, взаимодействующая в дальнейшем с пероксильными радикалами, ведущими цепи окисления:

RO2· + InH → ROOH + In·

Полученные данные могут представлять интерес с точки зрения расширения спектра фармакологического действия капотена и быть методологической основой для разработки новых подходов оценки взаимодействия антиоксидантов с компонентами клетки.

Выводы

1. Установлено, что синтетический ингибитор окисления дибунол в двух кинетических моделях в безводной и водно-липидной средах превосходит по своему действию природный антиоксидант a-токоферол.

2. Выявлена высокая антиоксидантная активность капотена в водно-липидных катализируемых субстратах, превышающая ингибирующие свойства a-токоферола и уступающая активности дибунола.

3. Установлено, что капотен в процессе окисления разрушаетгидропероксиды молекулярным путем. Вероятно, что способность разрушения гидропероксидов капотеном связана с наличием меркаптогруппы.