Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Онкологические больные относятся к особой группе риска в отношении развития инфекционных осложнений. Это связано как с дефектами иммунной системы, так и многочисленными инвазивными манипуляциями, длительными госпитализациями, многократными курсами химиолучевой терапии, агрессивной антимикробной терапией [5].

Успешное разрешение проблемы инфекционных осложнений у онкологических больных состоит как в их предупреждении, так и в этиологически оправданном и своевременном лечении. Для назначения этиотропной терапии необходима быстрая и точная идентификация этиологического агента инфекционного осложнения, а это диктует необходимость использования высокочувствительных и высокоспецифичных экспресс-методов диагностики.

Несмотря на широкое внедрение в работу микробиологических лабораторий новых автоматизированных систем для идентификации и определения чувствительности микроорганизмов классические культуральные методы не всегда бывают достаточно чувствительными. К недостаткам классических методов относится их длительность, особенно для медленнорастущих патогенов, невозможность детекции некультивируемых микроорганизмов, влияние антибактериальной терапии на результаты анализа. Этих недостатков лишены молекулярные методы, позволяющие осуществлять прямую идентификацию возбудителя в первичном клиническом материале.

Наиболее распространенными в клинической практике микробиологических исследований являются различные модификации ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [6]. Этот метод давно и успешно применяется в ряде областей лабораторной медицины, в частности для диагностики инфекций, передающихся половым путем, вирусных гепатитов. Однако в широкой практике микробиологических исследований других воспалительных заболеваний, в частности инфекций мочевых путей (ИМП) и раневых инфекций этот метод используется редко. В отдельных публикациях представлены результаты применения ПЦР-РВ для диагностики сепсиса и инфекционных осложнений у больных, находящихся в критическом состоянии [7, 8], ИМП [1]. В свете изложенного сопоставление результатов исследований, полученных с использованием классического культурального и молекулярного метода идентификации микроорганизмов, при развитии инфекционных осложнений у онкологических больных представляет актуальную задачу.

Цель исследования. Сравнительная оценка эффективности ПЦР в реальном времени и классического культурального метода в диагностике инфекционных осложнений у онкологических больных.

Материалы и методы исследования

Исследовано 55 образцов биологического материала, в том числе 33 образцов мочи, 8 образцов плевральной жидкости и 14 образцов отделяемого послеоперационной раны. Один и тот же образец изучали с помощью классического культурального метода и методик, разработанных ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. При использовании культурального метода видовую принадлежность изолированных штаммов и определение чувствительности определяли с помощью автоматической системы VITEK 2 (bioMerieux,Франция).

Экстракцию ДНК из клинического материала проводили с использованием набора реагентов «Рибо-преп» производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в соответствии с инструкцией производителя в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-FL). Предварительно 1 мл образца мочи центрифугировали при 11000g в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляли, к осадку добавляли 300 мкл лизирующего раствора. Далее процедура выделения ДНК соответствовала методике производителя. ДНК из образцов плевральной жидкости и раневого отделяемого выделяли без предварительной обработки.

Для обнаружения ДНК микроорганизмов использовали три методики ЦНИИЭ: «АмплиСенсЭнтеробактерии/G(+) для определения ДНК семейства (Enterobacteriaceae spp.), стафилококков (Staphylococcus spp.), стрептококков (Streptococcus spp.) и энтерококков (Enterococcus spp.), «АмплиСенсG(-)Ab/Kp/Pa/Ec-Fl» для определения ДНК Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и «АмплиСенс®ФлороЦеноз/Кандиды-Fl» для определения ДНК грибов рода Candida: C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis. Все методики основаны на использовании мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Для выполнения количественного анализа проводили одновременную амплификацию с детекцией для образцов ДНК, полученных из клинического материала и ДНК-калибраторов. Количество ДНК обнаруженных микроорганизмов в образцах биологического материала рассчитывали в геномных эквивалентах/мл (ГЭ/мл).

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ полученных данных показал, что нестерильными по результатам культурального исследования оказалось 39,4 % образцов мочи, 12,5 % плевральной жидкости и 53,8 % раневого отделяемого.

При исследовании этого же клинического материала методом ПЦР-РВ положительными были 60,6 % образцов мочи, 62,5 % образцов плевральной жидкости и 69,2 % образцов отделяемого операционной раны. Всего при классическом микробиологическом исследовании мочи было изолировано 16 культур микроорганизмов из 13 образцов (39,4 %), в ПЦР выявлена ДНК 28 микроорганизмов в 20 образцах (60,6 %).

При сопоставлении результатов исследования образцов мочи, полученных разными методами, из анализа были исключены образцы с количеством менее 10^3 ГЭ/мл (в ПЦР). Полное совпадение результатов отмечено в 28 случаях (66,6 %). В двух случаях в ПЦР был получен отрицательный результат при положительных результатах посевов (E. faecalis106 КОЕ/мл и E.coli 108 КОЕ/мл). В 12 случаях (28,6 %) при отрицательных результатах посевов в ПЦР был обнаружен генетический материал возбудителей ИМП (табл. 1). Уровень обсемененности при этом составил 103 ГЭ/мл (7 образцов), 104 ГЭ/мл (2 образца), 105 ГЭ/мл (2 образца) и 107 ГЭ/мл (один образец).

Дискордантные результаты, на наш взгляд, можно объяснить как большей чувствительность метода, так и возможностью определения ДНК погибших микроорганизмов, т.к. многие пациенты на момент обследования получали антибактериальные препараты.

В этиологической структуре ИМП у онкологических больных при поступлении в стационар преобладали традиционные уропатогены: E.coli, Enterococcus spp., Kl.pneumoniae (табл. 2). Однако ранговые значения различных патогенов при исследовании культуральным и молекулярным методом отличались. Так, при исследовании классическим методом чаще других была обнаружена Kl.pneumoniae, затем Enterococcus spp. и E.coli. При исследовании методом ПЦР-РВ чаще других была обнаружена ДНК E.coli, реже Kl.pneumoniae и Enterococcus spp. Моноинфекция была обнаружена в 10 случаях (76,9 % от положительных образцов) при исследовании культуральным методом и в 12 случаях (60,0 %) при исследовании методом ПЦР. Помимо рассмотренных случаев в двух образцах была обнаружена ДНК Ps.aeruginosa и в одном образце A.baumannii с уровнем обсемененности 102ГЭ/мл. Ps.aeruginosa, A.baumannii, Streptоcoccus spp. и грибы рода Candida были обнаружены только при использовании метода ПЦР.

В связи с этим на наш взгляд, в случае широкого использования ПЦР в рутинной практике необходимо продумать вопрос о правомочности автоматического переноса критериев интерпретации клинической значимости результатов, полученных с использованием культурального метода на метод молекулярный. В рассматриваемых случаях пациентам предстояло оперативное вмешательство на мочевом пузыре с трансуретральным доступом. И может быть, с учетом характера предстоящего вмешательства, целесообразно установить более тщательное наблюдение или дополнительное обследование пациентов с низким содержанием ДНК клинически значимых микроорганизмов в образцах мочи для своевременного выявления и адекватной терапии ранних послеоперационных осложнений.

Всего при классическом микробиологическом исследовании отделяемого послеоперационной раны и плевральный жидкости было изолировано 14 культур микроорганизмов в 8 образцах, в ПЦР обнаружена ДНК 31 микроорганизма в 13 образцах.

Полное совпадение результатов отмечено в 58,5 % случаев (табл. 3). В 41,5 % случаев генетический материал различных микроорганизмов был обнаружен в ПЦР и не обнаружен при посеве. При этом только в 7 образцах (41,2 %) количество ДНК было в пределах 104-107 ГЭ/мл, в 10 (58,8 %) случаях ДНК возбудителей бактериальных инфекций была обнаружена в количестве 103 ГЭ/мл.

В этиологической структуре возбудителей инфекционных осложнений при исследовании классическим культуральным методом преобладали Enterococcus spp., Ps. aeruginosa, E. coli и A.baumannii (табл. 4). При исследовании методом ПЦР-РВ чаще других была обнаружена ДНК E. coli, далее по мере уменьшения Enterococcus spp., Staphylococcus spp. и Ps. aeruginosa. Streptococcus spp. и грибы рода Candida были обнаружены толь методом ПЦР.

Таблица 1

Результаты параллельных исследований образцов мочи культуральным и молекулярным методом

Таблица 2

Структура возбудителей ИМП у онкологических больных при исследовании культуральным и молекулярным методом

Примечание. *ПЦР.

Таблица 3

Результаты параллельных исследований образцов раневого отделяемого и плевральной жидкости культуральным и молекулярным методом

Таблица 4

Структура возбудителей инфекционных осложнений у онкологических больных при исследовании культуральным и молекулярным методом

Примечание. *ПЦР.

Результаты исследований показали, что молекулярный метод детекции оказался более эффективным, чем классический культуральный. В случаях развития ИМП при использовании ПЦР-РВ различные патогены в клинически значимом количестве были обнаружены в 2,15 раза чаще (28 патогенов против 13), чем при использовании классического культурального метода, а при раневых инфекциях в 2,21 раз чаще (31 патоген против 14).

К недостаткам молекулярного метода относится возможность детекции только определенных, наиболее распространенных возбудителей бактериальных инфекций. В этом случае перед исследователем каждый раз стоит вопрос выбора определяемых патогенов в зависимости от задачи исследования и вида клинического материала (моча, ликвор, кровь, отделяемое раны). В условиях большого потока клинического материала трудно будет унифицировать подобные исследования. Другим недостатком молекулярного метода является невозможность определения чувствительности к конкретным антимикробным препаратам. Однако на отечественном рынке реагентов для in vitro диагностики уже доступны наборы для определения генов карбапенемаз и β-лактамаз. Ряд исследователей сообщали об опыте использования этих наборов [9]. Результаты изучения распространения генов резистентности у представителей семейства Enterobacteriaceae, A.baumannii, MRSA в онкологическом стационаре были также опубликованы нами ранее [3, 4, 10, 11].

Использование молекулярной детекции для этиологической диагностики ИМП и раневых инфекций значительно сокращает время анализа, что, в свою очередь, позволяет клиницистам принимать своевременные и обоснованные решения по терапии инфекционных осложнений у иммунокомпроментированных пациентов.

Классические микробиологические и молекулярные методы идентификации возбудителей инфекционных заболеваний не являются взаимозаменяемыми, но лишь дополняют друг друга. Учитывая скорость развития инфекционного процесса у онкологических больных исследования, проведенные с привлечением молекулярных методов, на наш взгляд, могут служить эффективным инструментом для своевременного выявления проблемных микроорганизмов, в том числе штаммов, несущих генетические детерминанты резистентности.

Выводы

Молекулярные методы являются более эффективными, позволяют быстро получить результат и могут быть рекомендованы в случаях необходимости принятия срочного решения о проведении или коррекции антибиотикотерапии с учетом данных локального микробиологического мониторинга.